蛋白质与核酸相互作用的试验方法学研究.pptxVIP

蛋白质与核酸相互作用的试验方法学研究第1页/共28页第2页/共28页DNA-蛋白质相互作用研究实验第3页/共28页引言1.很多细胞的生命活动涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用：DNA的复制和重组；mRNA的转录和修饰；病毒的感染与增殖等2.随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究显得尤为重要。而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域。而要深入研究基因表达调控的分子机制必须要研究DNA与蛋白质的相互作用。3.在重组DNA技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要生物学意义的基因。在这种情况下科学工作者开始把自己的研究兴趣逐渐转向DNA结合蛋白这一课题上。 第4页/共28页凝胶阻滞试验DNaseI足迹试验甲基化干扰试验体内足迹试验酵母单杂交技术染色质免疫沉淀技术噬菌体展示技术核酸适体技术生物信息学方法蛋白质芯片技术及纳米技术 第5页/共28页一、凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验DNA mobility shift assay）1 原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 第6页/共28页2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA）同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置 不存在与DNA结合的蛋白质时存在与DNA结合的蛋白质时第7页/共28页 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性 超量的非标记的竞争DNA (competitor DNA ）第8页/共28页第9页/共28页材料及试剂：2X结合缓冲液：20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、 poly(dI-dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-标记探针缓冲液C：20 mM HEPES pH 7.9、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、0.5 mM 二硫苏糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA4%天然的聚丙烯酰胺凝胶(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷，41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（过硫酸铵）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴烷电泳缓冲夜。填充染料：0.2% 溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50% 甘油操作步骤：1.配置反应混合液：探针DNA (1 ng/ml) 0.1ml、dH20 6.3 ml、2x 结合缓冲液 12.5 ml、BSA (10 mg/ml) 1.0 ml 、poly(dI-dC) (5 mg/ml) 0.1ml、2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5 ml。3.加10~15 mg上述溶液（￡ 5 ml)到反应混合物中，总体积应不大于25 ml。4.在室温下培养20min。5.加入2.5 ml的填充染料。6.装载样品到4%的聚丙烯酰胺凝胶柱中。7.室温下跑电泳2.5h，至溴酚蓝距底部1cm处停止。8.80℃下干燥凝胶，进行放射自显影处理。 第10页/共28页二、DNaseI足迹试验(DNaseI footprinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生“DNaseI保护”，尿素变性，PAGE分离及放射性显影，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相应于DNA结合蛋白的位置上由于DNA结合蛋白的保护作用而形成了空白区域。第11页/共28页如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区的精确序列。第12页/共28页三、甲基化干扰试验根据DMS （二甲基亚蓝）能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计 先用DMS处理DNA；（并控制反应条件，使之达到平均每条DNA分子只有一个残基被甲基化）将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当细胞提取物一道温育；并做凝胶阻滞试验。经电泳分离后，从凝胶中切除具有结合蛋白的DNA条带和没有结合蛋白的DNA条带，并用六氢吡啶处理之。 第13页/共28页 检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用