基因敲除新技术.pptxVIP

基因敲除新技术第1页/共62页 ZFN 技术原理锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。第2页/共62页 ZFN 技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。第3页/共62页 第4页/共62页 崭新的技术 - TALEN经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改 （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout） 片段删除 片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗崭新的技术解决经典的挑战第5页/共62页 靶向基因技术经典方法 ：自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！饱含希望与失望的技术：ZFN，被Sigma公司垄断新的里程碑：TALEN第6页/共62页 TALEN技术基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。第7页/共62页 1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基 TALEN 发展过程第8页/共62页 人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元…… 14 – 18个重复真核表达…… 14 – 18个重复特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合34氨基酸单元第9页/共62页 TALEN 发展过程第10页/共62页 TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体第11页/共62页 TALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级Donor plasmidHRDonor plasmidLeft armRight armDonor plasmidLeft armRight arm点突变片段删除基因敲入第12页/共62页 2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 一篇综述《Move over ZFN》TALEN的最前沿第13页/共62页 TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程选择、确定靶点2. TALE识别模块串联构建3. TALEN真核表达质粒构建4. TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5. 检测突变效率，筛选（移码）突变体X 2X 2X 2第14页/共62页