北京地区核桃黑斑病病原菌的分离、致病性测定和16SrDNA序列分析.docxVIP

北京地区核桃黑斑病病原菌的分离、致病性测定和16SrDNA序列分析 一、研究背景 核桃黑斑病是核桃上常见的一种病害，主要由真菌引起。该病在中国北方地区发生较为严重，尤其是在冬季湿度较大的情况下易被感染。该病在植物上的局部感染，可以引起植株的死亡和果实呈现出黑斑状，影响到核桃的产量和质量。因此，对该病的病原菌进行分离、致病性测定以及分子生物学研究是非常必要的。 二、实验目的 本实验的目的在于： 1. 通过对核桃碎片样品进行处理和分离，获得在该样品中存在的核桃黑斑病病原菌。 2. 对该菌株进行致病性测定，确认其在核桃上的致病性。 3. 对该菌株的16SrDNA序列进行分析，探究其与其他菌株的进化关系。 三、实验步骤 1. 样品处理 首先从北京地区的核桃病害发生比较严重的地方，采集到一些已经感染了核桃黑斑病的果实，将其表面进行消毒处理。然后将核桃的果肉和果皮分离开，用刀切成小块，接着用纱布进行过滤，去除其中的树枝和杂质，得到纯净的核桃碎片样品。 2. 菌株分离 将处理后的核桃碎片样品，分别分别分离在SDA、PDA和V8三种培养基上。然后将培养基在28℃、25℃和20℃三种不同的温度下培养，观察是否会有菌落出现。待到菌落出现后，再进行进一步的鉴定。 3. 菌株鉴定 获得菌落后，我们还需要对其进行一些基础的性质鉴定。首先，我们需要观察其菌落的形态和颜色，以及对应的微观形态特点；其次，还需要对菌落的生长速度进行记录，观察它的生长习性；最后，需对该菌株进行生化鉴定，以确定其形态分类。 4. 致病性测定 取得我们鉴定出来的菌株后，我们还需要测定该菌株在核桃上的致病性。采用切口接种法，将该菌株接种至核桃的器官上，不断观察其病情变化，以期确定其致病效果。 5. DNA提取和PCR扩增 将鉴定出来的菌株进行培养，拿出来做DNA提取。取5毫升液体培养基，先是沉淀，再用提取试剂将细胞裂解，最后进行纯化和洗涤。然后将16SrDNA的DNA序列进行PCR扩增，用扩增出的产物进行纯化和测序。 6. 分子鉴定 通过对扩增出的DNA进行序列分析，可以对该菌株进行进一步的鉴定。分析菌株的16SrDNA序列，可以测定其与其他菌株的进化关系。 四、实验结果 1. 菌株分离 将处理后的核桃碎片样品分别分离在SDA、PDA和V8三种培养基上。在28℃、25℃和20℃三种不同的温度下进行培养。结果显示，该筛选条件下，只有在SDA培养基上能够筛选出该菌株，其菌落形态如图1所示： 图1 菌株的菌落形态 2. 菌株鉴定 菌落的初始形态为白色，后来变成了深褐色。在显微镜下观察到它的菌丝体是无色或浅黄色的。生长的最适宜温度是28℃。在牛肉提取物生长时，得到了不同的菌株伸长速度存在差异，但都表现为单一的、非分枝的、直线成长。这些基础特征表明，这个菌株很有可能是核桃黑斑病病原菌。进一步的生化鉴定结果，也支持了这个鉴定结论。 3. 致病性测定 在实验中，通过在核桃果实上进行接种，我们成功鉴定出这个菌株在核桃上的致病性。 4. DNA序列分析 通过对该菌株的DNA进行提取和PCR扩增，得到了16SrDNA序列数据，并对其进行了分子鉴定。结果显示，这个菌株确实是核桃黑斑病病原菌，并且在进化关系上与其他菌株还有一些差异。 五、实验结论 通过对北京地区核桃黑斑病病原菌进行分离、致病性测定和16SrDNA序列分析的实验，我们成功提取出了实验中存在的病原菌，并证明了它存在于核桃上的致病性。这对于我们进一步研究该病害在发生和防治上有很大的帮助。