生化实验三果蔬中蛋白质含量测定.pptxVIP

生化实验三果蔬中蛋白质含量测定;综合实验一： 果蔬成分的生化分析;实验材料： 冬枣＋柚子——1～4组 梨（2个品种）——5～8组 盘菜＋萝卜 ——9～12组;实 验 三 果蔬中蛋白质含量的测定 （考马斯亮蓝法）;一、目的 1、掌握蛋白质测定的方法和技术。 2、了解果蔬中蛋白质的含量。;二、原理 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。;三、实验器材 1、可见光分光光度计 2、旋涡混合器 3、试管16支;四、实验试剂 1、标准蛋白质溶液——牛血清清蛋白(bsa)： 配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。 2、考马斯亮兰G-250染料试剂： 称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入120mL 85%的磷酸，用水稀释至1L。 3、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8） 4、各种果蔬;五、操作 1、标准曲线绘制： 取6支试管，按下表加入各试剂。; 加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。 以各管相应标准蛋白质含量（?g）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。;2、样品制备： 称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mL H2O或0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心15～20min，其上清液即为蛋白质提取液，供分析用。 （注：盘菜，萝卜稀释至10mL） ;3、样品测定： 试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。 根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。;注意事项： ⑴、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。 ⑵、测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用95%的乙醇将蓝色的比色杯洗干净。;实 验 三 果蔬中蛋白质含量的测定 （Folin-酚试剂法 ）;一、目的 1、掌握蛋白质测定的方法和技术。 2、了解果蔬中蛋白质的含量。;二、原理 Folin-酚试剂法是双缩脲法的发展。其试剂由甲、乙两部分组成。甲试剂相当于双缩脲试剂，可与肽键起呈色反应。乙试剂（即Folin-酚试剂）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色（钼蓝和钨兰的混合物），其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此通过比色可测定蛋白质的浓度。 本方法最大的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏10～20倍。;三、实验器材 1、分光光度计 2、电热恒温水浴箱 3、试管 15×150mm 4、刻度吸管 0.5mL、1mL、5mL 5、试管架 6、容量瓶 500mL 7、坐标纸;四、实验试剂 1、甲试剂： ①：2g无水碳酸钠，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL混匀； ②：称取CuSO4·5H2O 0.5g，加入1%（35mmol/L）酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。 使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。（混合后，试剂只能使用一天，但碱性溶液和0.5% CuSO4·5H2O溶液可分别长期保存） ;2、乙试剂： 在2L磨口回流装置中加入100g钨酸钠，25g钼酸钠及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%磷酸及100mL浓HCl，充分混合后用小火回流10小时。回流完毕冷却后，加入150g锂，50mL蒸馏水及液体溴数滴，摇匀后再开口沸腾15分钟，以驱逐过量溴。溶液冷却后稀释至1000mL，溶液呈透明淡黄色，置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。 使用前用标准NaOH溶液标定，以酚酞为指示剂，标定其酸度为1 mol/L，此为乙试剂应用液，置冰箱中可长期保存。;3、牛血清白蛋白标准液（200 ?g/mL）： 准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.