磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展.pdfVIP

* E-m 第 9 期 1383 酸磷酸盐抗体最为常用。免疫沉淀技术对抗体的要求更高, 抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进 行免疫沉淀实验。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小, 抗原抗体结合位点有空间 , 抗体的结 6 合力较差 , 所以多年来一直没有用于免疫沉淀分析。 7 Schumacher等 利用两种不同的磷酸化酪氨酸抗体对肿瘤细胞系 SUDHL1 裂解液分别经免疫沉 淀和免疫亲和层析富集磷酸化酪氨酸蛋白, 经质谱鉴定表明双抗免疫沉淀法可鉴定到 的磷酸化蛋白。 8 Pandey等 用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀表皮生长因子 (EGF)刺激后的 HeLa细胞总蛋白质和未刺激 的 HeLa细胞总蛋白质 , 通过 MS分析共鉴定出 7 个已知的 EGF激酶底物和 1个新的 EGF激酶底物 9 Vav2 。Chong等 也利用磷酸化酪氨酸抗体富集鉴定到 3 个新的 EGF信号通路下游的靶蛋白,并且 10 通过该方法还可对蛋白质相互作用进行研究。 Gronborg等 对多种商品化的抗磷酸丝氨酸 /苏氨酸抗 体的免疫沉淀性能进行了评价, 发现有 3 个抗磷酸丝氨酸 /苏氨酸抗体可应用于免疫沉淀 , 并成功富集 了磷酸酶抑制剂 CalyculinA诱导的 HeLa细胞磷酸化蛋白质。 2.2 激酶特异富集法 很多激酶不仅以相互协同的形式动态调控着信号通路, 而且还通过特异位点磷酸化来调控自身以及 11 不同激酶间的功能活性 。但是由于激酶相对于其底物来说丰度更低, 因此在已有的磷酸化蛋白质组学 研究中对于激酶的磷酸化位点的研究尤为不足。免疫沉淀技术可以用于大规模的磷酸化蛋白质组学研究, 磷酸化酪氨酸蛋白特异性抗体可以用于磷酸化激酶的富集, 但是这些方法不能对激酶进行特异性富集。为 了对激酶磷酸化状态进行研究, 利用小分子的磷酸激酶抑制剂对其进行特异亲和层析成为激酶磷酸化蛋 12 白质组学研究的重要方法 。另外激酶抑制剂与激酶结合蛋白共同富集显著提高了激 13 1 酶磷酸化蛋白质组学鉴定水平 。Godl等 首先利用激酶特异富集法对 p3 8 激酶的抑制剂 BS 203580 的作用底物进行研究, 他们利用螯合反应固定了 SB20 3 580 的亲和柱富集鉴定的几个未知的激 酶底物, 并且研究认为 :SB2 0 358 0 对 RICK[ Rpilike tnigcaspaselikeapoptosisregulatoryprotein 15 (CLARP)kinase/Rip2 /CARDIAK] 抑制作用更加灵敏。Daub等 利用激酶抑制剂亲和层析法对周期 阻滞到 S和 M期的 HeLaS3 细胞系进行了定性及定量研究, 他们采用同位素标记的固定培养技术对细 胞进行培养。细胞裂解后利用 5种不同的激酶抑制剂螯合的 3个层析柱进行连续富集, 洗脱液混合后进 行磷酸化蛋白组学分析, 对 219个 S和 M期的磷酸化激酶进行了定量分析, 同时鉴定了 1000多个激酶上 的磷酸化位点, 并且鉴定到新的与有丝 相关的激酶, 在细胞信号通路研究上显示了独特的优势。 2.3 亲和富集法 目前, 一些商品化的试剂盒主要采用磷酸化蛋白亲和富集法。利用磷酸基团与一些金属离子或金属氧 化物等的亲和作用, 实现对磷酸化蛋白的富集