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微生物HXP的学习课件第1页/共23页第2页/共23页大肠杆菌生长曲线的测定第3页/共23页大肠杆菌（介绍）为革兰氏阴性短杆菌，大小0.5*1-3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，使人和动物倡导中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠菌群数常作为饮用水和实物的卫生学标准。第4页/共23页主要特点1、细菌，原核生物；肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，无细胞核有拟核；细胞质中的质粒作基因工程中的运载体。 2．代谢类型：异养兼性厌氧型。 3．与人体关系：正常状况下，可认为互利共生（高中）；在致病的情况下，可认为寄生。 4．培养基中加入伊红美蓝，菌落呈深紫色，并有金属光泽，鉴别杆菌是否存在。 5.目前杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。 6．在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。 7．基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个环状质粒DNA 第5页/共23页生长周期细菌接种到均匀的液体培养基，在生长过程中，有以下生长周期。1.迟缓期（数量维持恒定，或增加很少）2.对数生长期（最大速率生长和分裂，细菌数呈对数增加）3.稳定生长期（细菌数最高并维持稳定）4.衰亡期（细菌死亡速率增加，活细菌减少）第6页/共23页生长曲线细菌的生长一般指群体的生长，常常具有一定的规律性。 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。第7页/共23页实验目的1.了解细菌生长曲线特点及测定原理；2.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线；3.学习用光电比浊法测定细菌的生长曲线。第8页/共23页目标与要求1.会使用分光光度计测定光密度值2．会培养不同浓度的菌液3．会使用恒温摇床培养细菌4．能用已测定光密度值绘制大肠埃希氏菌生长曲线第9页/共23页实验原理不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。 第10页/共23页项目八 大肠杆菌生长曲线的测定接受指令查找依据制定计划实施操作工作过程2.取样3.接种4.培养1.备料、灭菌5.结果处理6.报告结果7.评价质量第11页/共23页工作准备1.菌种：大肠杆菌(大肠埃希菌）2.培养基：营养肉汤培养基（配法书上134页）3.仪器和器具：721光电比色计，恒温摇床，无菌吸管10mL，试管，无菌平皿，酒精灯，接种环，培养箱，三角瓶。 第12页/共23页操作步骤接种培养分别用10ml无菌吸管吸取5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有100ml?营养肉汤?的三角瓶内，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。将九组三角瓶置于摇床上，37℃,220r/min,振荡培养。间隔一段时间后（即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18h），从摇床上取下一瓶培养物(标记时间），置4 ℃冰箱培养。第13页/共23页分光光度计比浊测定 每组取10支干净小试管，从不同时间培养菌液中摇匀各取3ml，将大肠埃希菌培养液进行适当稀释，使光密度在0.1-0.65之间，以没有接种的空白对照组培养基调零点，在550nm或600nm波长，1cm比色杯中依次进行测定OD值。测定从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。 经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，才是培养的实际OD值第14页/共23页1.选择试管时应选取质地相同，内外直径一致，管壁厚薄均匀的试管。在比色管架上以分光光度计的计值法选取则更为精确。2.在生长曲线测定中，要用空白对照管的培养液校正光度计的零点。注意事项第15页/共23页3.测OD值前，培养液振荡，细胞均匀分布。后将比色杯的菌液倾入容器中，用水冲洗，水集于容器灭菌，用75%酒精冲洗比色杯。4.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定5.严格控制培养时间第16页/共23页实验报告:将测定的OD600值填入下表：时间对照组8101213141516171819光密度值（OD600）第17页/共23页绘制生长曲线以光密度（OD值）为纵坐标，生长时间为横坐标，作出大肠埃希菌生长曲线。，并说明大肠杆菌生长特征。第18页/共23页思考题(1)为什么比浊法测定细菌的生长只表示细菌的相对生长状况?它有何优点？(2)