二基因工程基本知识及基本技术.pptxVIP

二基因工程基本知识及基本技术;第一节 基因的结构特点;一、原核生物基因结构特点;二、真核生物基因结构特点;第二节 基因表达;一、原核生物基因表达;二、真核生物基因表达;第三节 操纵子学说;乳糖操纵子基因表达调控模型;二、操纵子调节的类型;B 基因工程的支撑技术;第一节 DNA的提取与纯化;一、质粒DNA的提取;闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；;;（2） 所用的试剂作用;③EDTA;冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。;⑦ RNase A;蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀,但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。;（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 ;溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。;上清液中含有闭合质粒DNA。;最重要的是：;这是直接决定DNA产量的重要因素之一。;二、基因组或其他DNA的提取;动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。;（3）纯化DNA;（1）组织粉碎;;三、DNA的定量和纯度测定;第32页/共166页;;一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。;DNA ladder;1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 ;;Relaxed ;;二 、琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖的浓度（%）;4.低熔点胶(LMP);EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。; ;;UVP全自动凝胶成像分析系统;OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统;优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。实用于蛋白质分离分析及DNA序列测定;1 SDS电泳所用溶液 ;SDS电泳所用5%浓缩胶(8 ml): 水5.5 ml,30%丙烯酰胺溶液1.3 ml,1.0mol/L Tris (pH6.8) 1.0ml, 10%SDS 0.08 ml,10%过硫酸铵 0.08 ml,TEMED 0.008ml 30%丙烯酰胺贮存液: 29% (W/V) 丙烯酰胺加 1%(W/V) N N′-亚甲基双丙烯酰胺,以双蒸水溶解,用滤纸过滤溶液,去除不溶杂质,确定溶液pH值不超过7.0,置于棕色瓶4℃保存。;Marker;一、基因扩增（gene amplification);;生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。;（1）;;（3）Taq DNA 聚合酶;;2. PCR技术的原理;双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。;TGCATGCAT;DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。;理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。;3. PCR的过程;;;;需要的模板量极低。;RT-PCR：;自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。;最适温度： 75-80 oC 最长延伸长度：6.7kb;金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。;（2）其它耐热的 DNA聚合酶 ;;与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。;③引物的碱基序列 ;尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力，G+C含量通常为40%-60% ;3）避免形成引物二聚体（dimer）;⑤ 引物的Tm值;;设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。;;但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。; dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 ;Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。;借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 ;扩增两个引物外侧的未知序列;;（4）反转录PCR（RT-PCR) ;（1）提取基因组 total RNA;;7. PCR技术的应用;在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。;利用6bp