大熊猫FABP4、FABP5及RPS9基因克隆与表达.docxVIP

大熊猫FABP4、FABP5及RPS9基因克隆与表达 引言 大熊猫是珍稀的国宝动物，目前全球仅存不到2000只，其中99%的野生大熊猫生活在中国四川、陕西、甘肃等地。大熊猫的生存环境受到人类活动的影响，野生种群数量稀少，保护状况十分紧急。为了更好的保护大熊猫，需要深入了解大熊猫的生理涵义和其抗逆性的分子机制。本文主要介绍大熊猫的FABP4、FABP5及RPS9基因的克隆和表达。 材料与方法 实验动物 3只成年、健康的大熊猫。大熊猫来源于四川大熊猫研究与保护中心。 PCR扩增 提取大熊猫脂肪组织RNA，利用RT-PCR扩增FABP4、FABP5及RPS9基因。将扩增出的基因片段进行酶切，连接至pGEM-T载体中，然后转化至大肠杆菌（E.coli）感受态细胞中进行纯化，通过测序鉴定克隆的准确性。利用Plasmid Mini Kit（QIAGEN）提取纯化后的重组质粒。 原核表达 将序列核酸片段导入到某一原核表达载体中，例如pET21a，转化到大肠杆菌宿主菌BL21 star（DE3）中，表达蛋白质。将细菌菌落在液体培养基中培养，收集菌体，将菌体在不同时间点进行诱导表达，采用SDS对表达的蛋白质进行分离分析。将分离出来的蛋白质纯化、重组、鉴定，存储于-80°C下备用。 结果 克隆与鉴定 通过RT-PCR技术，成功扩增出大熊猫FABP4、FABP5及RPS9基因，所扩增的基因长度分别为92