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第1页/共40页b植物基因工程下第2页/共40页三、改进转基因的技术第3页/共40页（一）转基因植物中外源基因的沉默在转基因研究中经常碰到一种引起基因失活的现象称为基因沉默（gene silencing）。基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上：1. 发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应；2. 发生在RNA转录水平上的转基因沉默叫转录失活；3. 发生在转录后水平的转基因沉默叫共抑制。第4页/共40页1. 位置效应位置效应是指基因受寄主染色体基因组上的插入部位及周围核苷酸组成的影响。如果整合发生在转录活跃的常染色体上，毗邻寄主基因的调控系列将影响到外源基因的表达；如果插入到重复DNA或异染色体中或旁边，外源基因可能会失活。第5页/共40页2. DNA甲基化植物DNA 甲基化程度是较高的，核基因组中几乎20%-30%的胞嘧啶处于甲基化状态。外源基因编码区域的甲基化对基因表达的作用不明显，通常检测不到对转录的影响；外源基因启动子区域或5’端非编码区域的甲基化会引起启动子失活或不能起始转录，在转录水平上诱导了外源基因的沉默。第6页/共40页3. 重复序列诱发基因沉默通过电击法等将DNA直接导入植株，外源基因往往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。重复序列诱发的基因沉默（repeat induced gene silencing, RIGS）与重复序列间的异位配对和DNA的甲基化相关。一般一个位点插入的外源基因的拷贝数越多，失活的程度越高。第7页/共40页3. 重复序列诱发基因沉默解决方案有： 对外源基因及启动子进行改造，保证设计的序列与植物基因组有很短的同源序列，避免异位配对的发生； 使用基因枪法及电击法等直接DNA导入法容易引起多拷贝基因的插入，而使用农杆菌转化法可在一定的程度上避免多拷贝基因的插入； 在筛选作为育种材料的转基因植物时，尽量选择单拷贝插入的个体，采用RT-PCR法可以筛选到单拷贝插入的个体。第8页/共40页4. 共抑制共抑制是一种基因间相互作用引起的沉默现象。当引入一个与植物内源基因有部分同源性的DNA 时，不但外源基因不能高效表达，反而抑制了内源基因的表达。第9页/共40页二、提高外源基因表达水平的策略第10页/共40页1. 转化方法的影响基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细胞中的整合，导致转基因沉默，而农杆菌介导的遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少，可以在一定的程度上避免这个问题。第11页/共40页2. 使用信号肽植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中的表达，除使用专门的启动子外，使用特定的信号肽序列是必需的。第12页/共40页3. 选择强启动子和诱导型启动子选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的一个有效手段。通常来源于双子叶植物的启动子，在双子叶植物中的表达效率要比在单子叶植物中高得多，反之亦然。有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达，而要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表达。这就需要使用诱导型启动子，其在特定的条件下诱导在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。第13页/共40页4. 强终止子在植物转化的研究中，两个常用的终止子是CaMV 35S启动子和根瘤土壤杆菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子。其PolyA尾巴和其中的茎-环结构，可有效地抵御核酸酶的水解作用，使mRNA 分子保持稳定性。第14页/共40页5. 消除甲基化的影响已知用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用。人们还试图在载体上加上去甲基化功能的序列来防止甲基化。第15页/共40页6. 使用植物偏爱的密码子转基因的密码子和植物基因组DNA的不同容易引起甲基化和表达效率低。在遗传转化前有必要优化转基因的密码子，尽量使用一些植物偏爱的密码子。第16页/共40页7. 使用MAR序列基质结合区（matrix attachment region, MAR）也叫核骨架结合区（scaffold attachment region, SAR）长度一般为300-1000bp，它可以与核骨架结合，在两个MAR 间的染色质区域可形成DNA 环，环的大小为5-200kb，每一个环为一个独立的表达结构。利用MAR 的这一特性，可创造一个独立的结构域，减少了插入位点附近染色质的影响，从而可以避免位置效应的影响，还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。第17页/共40页8. 使用增强子动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段的去甲基化，启动基因的转录。在植物中分离相应的增强子，并和外源基因重组，可确保转基因按合适的调控模式表达。第18页/共40页9. 外源基因的修饰和改造（1）避免基因间的同源性；（2）避免重