天津医科大学抗体纯化与鉴定技术.pptx

天津医科大学抗体纯化与鉴定技术 第1页/共32页 抗体纯化与鉴定技术 临床免疫学教研室 第2页/共32页 3 抗体纯化的目的 去除： 杂抗体（交叉反应抗体） 杂蛋白（提纯IgG及其片段） 第3页/共32页 盐析法粗提丙种球蛋白 方法一: 第4页/共32页 5 实验原理： 蛋白质溶解度在一定范围内随盐的浓度变化而变化。在低盐浓度下溶解度随盐的浓度升高而增加，当盐浓度达到一定水平时，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。 第5页/共32页 6 实验原理： 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。 第6页/共32页 7 实验原理： 同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 第7页/共32页 8 主要试剂： 饱和硫酸铵溶液 温度系数小，溶解度大（767 g/L） 不同饱和度析出蛋白质会依次析出； 价格便宜； 不容易引起蛋白质变性； 第8页/共32页 9 主要试剂： 饱和硫酸铵溶液 硫酸铵800g~850g溶于 1000ml H2O加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0。 0.01Mol/L pH7.4 PB 第9页/共32页 10 操作： 技术路线 分离血清等倍稀释 50%饱和硫酸铵沉淀留沉淀 33%饱和硫酸铵沉淀留沉淀 第10页/共32页 11 操作： 注意事项 硫酸铵的质量 饱和硫酸铵溶液配制 蛋白质浓度 盐析过程 脱盐 第11页/共32页 12 操作： 透析除盐 第12页/共32页 葡萄球菌蛋白A亲和层析提取IgG 方法二: 第13页/共32页 14 实验原理： 蛋白A（ Protein A ）或蛋白G（ Protein G ）是细菌胞壁蛋白，它们能结合抗体Fc段。天然 Protein G具有3个IgG结合域， 天然的Protein A具有5个IgG结合域。这一结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化敏感，抗体/蛋白A或蛋白G的亲和力随pH的降低而急剧降低。 第14页/共32页 15 实验原理： 对于哺乳动物IgG,Protein A比Protein G具有更大的亲和力,尤其是对于IgG的一些亚类,包括人类的IgG3、小鼠的IgG1即达鼠的IgG2a.   第15页/共32页 16 实验原理： 第16页/共32页 17 主要试剂： 层析载体 共价结合有蛋白A或蛋白G的树脂 琼脂糖微球 聚丙烯酰胺微球 性质稳定，价格低廉 第17页/共32页 18 主要试剂： 平衡缓冲液 0.01Mol/L pH7.4 PB 洗脱缓冲液 柠檬酸缓冲液 pH=3 柠檬酸缓冲液 pH=6 第18页/共32页 19 主要试剂： 中和缓冲液 氨基丁三醇-氯化钠 pH=3 pH=6 第19页/共32页 20 操作： 装柱 平衡 pH7.4 PB pH3 洗脱缓冲液 pH8.9 结合缓冲液 pH6 洗脱缓冲液 pH3 洗脱缓冲液 第20页/共32页 21 操作： 第21页/共32页 22 注意问题： 第22页/共32页 DEAE离子交换层析提取IgG 方法三: 第23页/共32页 24 实验原理： DEAE-Sephadex A-50 阴离子交换树脂能吸附阳离子； 血清中的γ-球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。在pH7.2～7.4的环境中, 酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，γ-球蛋白不被吸附而得以纯化。 第24页/共32页 25 操作： 装柱 平衡 pH7.2 PB 上样 收集 第25页/共32页 26 操作： 第26页/共32页 抗体特异性纯化 方法四: 第27页/共32页 28 去除交叉反应抗体，提高免疫血清特异性 免疫亲和层析是去除 交叉反应抗体最有效 手段 第28页/共32页 纯化抗体的鉴定 方法四: 第29页/共32页 30 免疫血清鉴定 鉴定特异性 抗体纯度 测定效价 抗体亲和力 第30页/共32页 31 免疫血清保存 冷冻保存 冷冻干燥保存 4℃保存 第31页/共32页 谢谢观看！ 第32页/共32页