生物学荧光定量PCR技术适用.pptxVIP

生物学荧光定量PCR技术适用第1页/共115页第2页/共115页定量PCR是如何工作的第3页/共115页荧光定量PCR是什么一种实时监控目的基因PCR 扩增的技术第4页/共115页AGTTGACAGCGMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+定量PCR是如何工作的?传统PCR 具有以下基本要素dsDNA模版, primers引物, dNTPs核苷酸, PCR buffer缓冲液, Taq polymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT第5页/共115页定量PCR是如何工作的?与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行: 双链DNA模板变性 引物与模板退火 引物延伸?? 新的扩增片段理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍第6页/共115页定量PCR是如何工作的?在PCR混合液中含有荧光物质。第7页/共115页定量PCR是如何工作的?无论哪个型号，所有的荧光定量 PCR仪都有三个共同的组成部分第8页/共115页Lots of PCR定量PCR是如何工作的?随着扩增的进行, 荧光信号会随着PCR产物的增加而增加PCRPCRPCR product第9页/共115页Cycle 1Filter ASample 1Level:定量PCR是如何工作的?Real-time PCR仪会记录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化第10页/共115页为什么要用定量PCR？一个好的定量PCR数据 重复性好 灵敏度高 动力学范围宽第11页/共115页PCR的动力学曲线和四个阶段第12页/共115页1: 重复性好第13页/共115页2: 灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因第14页/共115页3: 动态范围宽兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围(越大越好)第15页/共115页重复性准确性动态范围3个阶段中最佳时期指数扩增期第16页/共115页只有一个扩增期提供高质量的数据指数扩增期第17页/共115页为什么要用定量PCR？ 快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。第18页/共115页为什么要用定量PCR？ 安全：不用EB或放射性物质第19页/共115页定量PCR的化学原理第20页/共115页TaqMan?SYBR? Green I支持的化学试剂第21页/共115页TaqMan? 化学原理 TaqMan? 中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物第22页/共115页TaqMan? 化学原理 第三段短片段序列，又称为探针, 位于序列中间第23页/共115页TaqMan? 化学原理 探针标记两种 染料分子报告染料Reporter dye淬灭染料Quencher dye第24页/共115页光 (激发)TaqMan? 化学原理 完整的探针Reporter没有荧光信号（发射）能量第25页/共115页 光能TaqMan? 化学原理 然而，如果探针断裂了……第26页/共115页TaqMan? 化学原理 Denaturation变性 (95oC)第27页/共115页TaqMan? 化学原理 Annealing退火 (60oC)第28页/共115页Taq酶登场……TaqMan? 化学原理 第29页/共115页找到引物序列……TaqMan? 化学原理 第30页/共115页开始延伸 (60oC)TaqMan? 化学原理 第31页/共115页Extension延伸 (60oC)TaqMan? 化学原理 第32页/共115页Extension延伸 (60oC)TaqMan? 化学原理 第33页/共115页TaqMan? 化学原理 Extension延伸 (60oC)?第34页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段第35页/共115页Taq酶降解探针TaqMan? 化学原理 第36页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第37页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第38页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第39页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第40页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第41页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第42页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第43页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第44页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第45页/共115页TaqMan? 化学原理 Taq酶降解探针第46页/共115页T