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无菌检查培训第1页/共23页 培养基的质量控制第2页/共23页 检查范围：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基。目的：确证实验所用培养基是否符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。检查时间：供试品的无菌检查前或无菌检查同时进行。第3页/共23页 注意：1. 培养基配置应使用洁净的玻璃容器，不能使用金属容器。配置好的培养基应尽快进行灭菌处理，以免长菌。2. 灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。第4页/共23页 3. 如果实验室使用的是购买的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。同时应注意培养基有效期。第5页/共23页 第6页/共23页 第7页/共23页 4. 建议在进行正式实验前先完成对培养基质量的检查。如果在进行灵敏度试验的同时，也使用该培养基进行样品检查，那么，一旦培养基的无菌性或灵明度不符合规定，则检验结果应无效。第8页/共23页 菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特征。实验用菌应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。第9页/共23页 灵敏度检查所需的六种菌：金黄色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]铜绿假单胞菌 [CMCC (B)10104]枯草芽孢杆菌[CMCC (B)63501]生孢梭菌[CMCC(B)64941]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]第10页/共23页 菌液制备1. 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中， 30～35℃培养18～24小时接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时2. 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48小时上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液逐管稀释成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。第11页/共23页 3. 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁斜面琼脂培养基上23～28℃培养5～7天，用适量0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液逐管稀释成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。第12页/共23页 无菌性检查在进行灵敏度检查前应先进行培养基的无菌性检查方法：每批培养基随机抽取不少于5瓶，在相应温度下培养14天，应无菌生长。第13页/共23页 培养基的灵敏度检查1.分别接种小于100cfu的 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 至每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基中（各接２支）另取一支不接种作为空白对照，32～37℃培养3天 第14页/共23页 2.分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌 至每管装量为9ml的改良马丁培养基中（各接２支）另取一支不接种作为空白对照，23～28 ℃培养５天3.逐日观察结果第15页/共23页 结果判断1. 空白对照管应无菌生长2. 加菌的培养基管均应生长良好可判断培养基灵敏度检查符合规定第16页/共23页 注意事项：1. 配置培养基用水应使用满足要求的配制用水。2. 微生物的生长繁殖除需要一定的营养物质以外，还要求适当的pH范围。不同微生物对pH的要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH为中性或微碱性的。 pH 测试：培养基冷却后须进行 pH 测试。如果 pH 测得值与预期值相差 0.2 单位，则需要酸碱调节。第17页/共23页 3. 如对实验结果有怀疑，可将新、老批号培养基在相同的条件下同时进行试验。或设立对照培养基（如进口培养基）。4. 标准菌株（如 ATCC 或NCTC标准菌株或CMCC）及经过准确鉴定的临床分离菌。试验前对菌种进行传代培养，对照菌株必须使用新鲜培养物。一旦发现对照菌株污染或存在问题，则应立即更换。第18页/共23页 5. 培养基临用前检查：需气、厌气菌培养基应在临用前检查，培养基上部约1/10~1/5处呈现淡红色时可以使用，若淡红色部分超过1/5高度时，应将培养基用100℃水浴加热至粉红色消失后，迅速冷却至45℃以下再进行实验。只限加热一次，全管呈现淡红色时，不得再用。第19页/共23页 6. 配制好的培养基应保存在2～25 ℃、避光的环境，一般在三周内使用。生化鉴别用培养基，应在一周内使用；选择性分离鉴别培养基最好当日使用，必要时于冷暗避光处保存，最多不得超过三天。第20页/共23页 7.各种基础营养培养基，用前应尽量避免反复加热，多次的加热会使营养成分被破坏。凡受污染、长过细菌的培养基