葡聚糖凝胶测蛋白质分子量.pptxVIP

葡聚糖凝胶测蛋白质分子量; 目的要求： 1、学习凝胶过滤法的操作方法 2、学习使用凝胶过滤法测定蛋白质的相对分子量 实验原理： 凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel?filtration）是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，葡聚糖凝胶是由线性葡聚糖和交联剂组成的有不同孔隙度的立体网状结构，根据物质在凝胶颗粒的微孔中扩散的速率进行分离，大分子移动的速度快，先被洗脱出来，而小分子物质移动的速度慢，后被洗脱出来。; 不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200为每克干胶吸水20克。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。 ; 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 ; 将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total?volume）表示。Vt是由三部分组成，包括内水容积Vi、外水体积V0 和凝胶本身的体积Vg 。内水容积Vi是凝胶孔隙所占的体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得。外水体积V0指凝胶颗粒间的自由空间所占的体积，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积。利用有颜色以便于观察的蛋白质，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000通过实际测量求出 。 当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不渗入到凝胶内部，只需V0体积的洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端；相反，如果样品体积小于孔隙，则需要V0＋Vi体积的洗脱液，才能将它们由一端洗脱到另一端。中等分子（分子大小在上述两种极限之间）所需洗脱液体积介于两者之间，Ve＝V0＋KdVi（0Kd1）， Kd为分配系数，它表示一种物质在孔隙内的渗透程度，相当于这种物质在孔隙内所占体积和孔隙总体积的比值。 ; 对某一凝胶介质，如果两种分子全排出，即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但没有分离效果。同样两种分子如???能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们虽然分子大小有不同，但也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。 实际工作时，有时Kd＞1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve＞Vo+Vi，例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值。 不同大小分子量的蛋白质，进入凝胶筛孔的程度不同，其洗脱体积决定于分子大小，蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。若用已知分子量的标准蛋白质在一定型号葡聚糖凝胶柱上层析，精确测其洗脱体积，并以洗脱体积Ve对分子量的对数logMW作图，可获得一条标准曲线。未知分子量的蛋白质在相同条件下层析，根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。; 试剂和材料 洗脱液：0.05M Tris-HCl缓冲液（pH7.5），0.1M KCl溶液：称取12.12g Tris，15g KCl，先用少量去离子水溶解，再加入6.67mL浓HCl，用去离子水定容至2L。 蓝色葡聚糖2000(10mg/ml)；Sephsdex G-100；牛血清白蛋白（2mg/ml)（Mr 67 000);细胞色素c（Mr 12 800） 器材 层析柱 蠕动泵 核酸蛋白检测仪 自动部分收集器 记录仪 实验步骤： 一、溶胀凝胶 取Sephadex G-100 3g，加200mL蒸馏水，沸水浴中溶胀5小时。待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。溶胀平衡和漂洗净的凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。 二、装柱 层析柱必须粗细均匀，通常柱愈长，分离效果愈好，但柱过长，反而分离效果不好。; 装柱时，将柱垂直至于铁架上。在柱中加约1/3柱容积的洗脱液，并赶净尼龙膜下方气泡，完全使柱子底部充满液体，将柱的出口关闭。将凝胶上面过多的溶液倾出。把已经溶胀好的凝胶调成薄浆，倾入柱内，胶粒逐渐扩散下沉。当沉积的胶床至2～3cm高时，打开柱的出口，并注意控制流速均匀直到胶装完。待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口，再以洗脱液平衡柱层，直至层析的胶床高不变。 柱装得是否均匀，可用蓝色葡聚糖上柱检验；如果色带均匀下移，说