流式细胞术之基本原理及运用.ppt

主要内容 一、流式细胞仪结构和原理 流式细胞术简介 流式细胞仪的结构组成 流式细胞仪的光信号检测 流式分选 二、流式细胞术在生物医学中的应用 目前一页\总数三十四页\编于十二点 1.1 流式细胞术简介 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 目前二页\总数三十四页\编于十二点 流式细胞术的特点 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选； 目前三页\总数三十四页\编于十二点 流式细胞仪的发展及商品化 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。 目前四页\总数三十四页\编于十二点 流式细胞仪的分类 分析型流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。 分选型流式细胞仪 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。 目前五页\总数三十四页\编于十二点 1.2 流式细胞仪的结构组成 液流系统 流动室 液流驱动系统 光路系统 激发光源 光束收集系统 电子系统 光电转换器 数据处理系统 细胞分选系统 喷嘴 电偏转板 样本收集器 目前六页\总数三十四页\编于十二点 1.2.1 液流系统 鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。 流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。 鞘液 鞘液 细胞流 激光照射点 流体动力学聚焦示意图 目前七页\总数三十四页\编于十二点 流式细胞仪液流系统示意图 目前八页\总数三十四页\编于十二点 流动室 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。 进样孔 荧光信号 激光束 鞘液Sheath 流动室结构图：单细胞发生器 目前九页\总数三十四页\编于十二点 1.2.2 光路系统 （一）激发光源 ：激光器 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器 目前十页\总数三十四页\编于十二点 （二）光束成行系统 FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。 * 目前十一页\总数三十四页\编于十二点 （三）光收集系统 滤光片的组成 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。 Long pass Short pass Band pass 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 460 500 540 460 500 540 目前十二页\总数三十四页\编于十二点 1.2.3 电子系统 光信号　　电信号　　数字信号 目前十三页\总数三十四页\编于十二点 （一）光电检测器(photodetector) 光电二极管(photodiode) 　　　光灵敏度低，测定强信号（FSC）； 光电倍增管(photomultiplier, PMT) 　　　光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。 PMT 前向散射光 光电二极管 目前十四页\总数三十四页\编于十二点 （二）电信号两种