微生物基因组学.pptxVIP

微生物基因组学;一、概述;3、微生物基因组学的主要研究内容 ⑴从研究工作的内容而言 ①结构基因组学 ②功能基因组学 ③比较基因组学;二、微生物基因组的序列测定 ㈠测序目的 研究基因组的前提和基础。 ㈡测序策略 1.应根据待测序列的长度、要求测序的精确度和现有的条件来制定测序策略。 2.测序类型分为两类:①确认性测序 ②从头测序 ;大规模基因组测序的几个支撑技术;DNA测序有几种方法，但到目前为止最常用的 是20世纪70年代中期发明的链终止（Sanger 法）;;Sanger 双脱氧末端终止法测序原理;自动化测序;第10页/共61页;第11页/共61页;第一代测序技术：Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法。;美国X奖基金会2006年10月4日宣布设立一项金额高达1000万美元的奖金，激励科学家“多快好省”地绘制出人类基因图谱。 规则：在30天内以高精确度测序100个百岁老人基因组样本，并覆盖98%的基因组，每个基因组的测序费用控制在1000美元或以下。;㈢微生物基因组测序的策略 1.随机测序法 即不考虑方向性，随机对靶DNA进行测序，最后采用计算机拼装而得到完整的序列信息。该方法又包括两种方法。 ⑴鸟枪法 它包含有三种消化法 ①限制性内切酶消化法②超声波处理法③胰DNA酶消化法;⑵人工转座子法 转座子是具有跳跃功能的DNA元件，是细菌或酵母染色体上的特定基因区，利用转座酶可使转座子随机插入靶DNA。 优点： ①一次体外反应即可形成大量转座子的插入。 ②可以在其上加入更有利于DNA测序（或制图）的基因元件。 ③人工合成的转座子两头带有特殊的引物位点，所以插入位点的两侧序列可有效迅速地得以确定。;;1951. Barbara McClintock 提出转作和跳跃基因的概念 DNA;;2.定向测序法 是指特定地从目的片段的某一端开始测序，直至把靶片段测完。定向测序法包括引物测序法和定向缺失测序法。 ⑴引物测序法 即在第一次测序结果的基础上，设计新的寡核苷酸，来充当下一次测序反应的引物，并依次类推，从而循序渐进获得靶DNA的全部序列。;⑵定向缺失法 定向缺失法是将一个靶DNA变成若干套嵌套的缺失突变体，使靶序列中远不可测的区段逐渐落入可用通用引物进行测序的方法。;第21页/共61页;作图法测序与序列组装; 两种大规模基因组测序策略的比较 ;24;;酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes 简称YAC），是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。;细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。;（四）影响测序的因素 不管采用随机测序还是定向测序都可碰到下列影响因素。 1.计算机的设备 。 2.靶DNA的性质。 3.完成测序所需的时间 。 4.采用测序策略。;三．微生物基因组的注释 （一）概念：在微生物基因测序的基础上，对其基本结构和部件进行认定，以进一步研究其功能。;（二）微生物基因组注释的内容 1.碱基组成分析，即G+C Mol%测定。 G+C含量是物种的一个重要特征，在微生物的分类上具有重要意义，是重要参数之一。 2．开放阅读框的鉴定： 3．编码序列分析;4.tRNA基因检索：根据特异的三叶草结构来鉴定，可采用专门的分析软件。 5.rRNA基因检索：利用现有已知16srRNA序列来鉴定基因组含的rRNA基因。 6.特殊序列检索 7.复制原点鉴定 （1）鉴定目的 复制原点即微生物基因组1号碱基的位置。 （2）鉴定原理 复制原点有其特殊的结构。如E.coli的复制原点为为一段245个bp的序列，其中包含有四个核苷酸的9聚体“TTATCCACT”。 （3）鉴定方法 可采用特殊的分析软件。;第32页/共61页;8.同源性基因检索 （1）目的 对每一未知基因均进行同源性搜索以确定其基因的初步特性。 （2）搜索原理 根据其结构、排列的同源性。 （3）搜索方法 采用美国的BLAST软件。;四．微生物的基因组图谱 微生物的基因组图谱主要包括两种，即遗传图谱和物理图谱。 (一)遗传图谱 1.概念 是通过突变表型鉴定出来的其基因组上的一系列基因图，包括各个基因在基因组中的排列顺序和精确定位。;2.建立基因遗传图谱的方法 (1)中断杂交法 即将两个菌株共同培养,并每隔一段时间中断培养,以鉴定其基因型,并以鉴定某些基因的转化顺序和位置。 (2)噬菌体转导试验 PI噬菌体是普遍性转导噬菌体。它可在供体菌的D