免疫胶体金标记手册.docVIP

浙江大学电子显微镜室　　　浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维　　洪 健 徐　颖 浙江大学 2０0１年10月 一、胶体金的制备 依照不同的制备方法,能够制备出直径1－500ｎm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在３－3０nm范围内。 在氯化金(ＨAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,能够控制所产生的粒子大小、即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的１/８。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3～16ｎm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0。１～０。2％的H２Ｏ2能够去除这些残基。双标记或制备5—１0　nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,能够制备12~15０　nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12—16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也能够用磷作为还原剂来制备5 ｎｍ的胶体金,它幸免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大、磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法差不多特别少使用、 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0、5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的能够用1、5　ml试管分装为1 ml保存(—20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)、配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0、２２　?m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可４℃保存6个月以上或室温下保存1—２个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但不管无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明差不多过期、 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备３~１6 ｎｍ胶体金 取一25０ ｍl三角瓶,加入79 ml双蒸水和１ ｍl 1%氯化金,预热至６0～70℃。 取一5０　ml烧杯,加入4 ｍl 1％柠檬酸钠,然后依照所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM Ｋ２CＯ3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性ｐＨ。因此假如单宁酸的量少于0。5 ｍｌ时,对ｐH的影响不大,Ｋ2CO３能够省略。 将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温10分钟。自然冷却。 柠檬酸钠(ml) 单宁酸(?ｌ) 胶体金(nm) 4 ５000 ３ ４ 20０0 4 4 5０0 6 4 １2０ 8 4 70 10 4 10 １6 2、白磷还原法制备５ nm胶体金 取250　mｌ三角瓶一个,加７９　mｌ双蒸水,1　ｍｌ １％氯化金,并用0。25 Ｍ Ｋ2CO３将溶液调至中性(pH7。0)、 取0、2 ｍl饱和磷/乙醚溶液加到1。5 ml试管中,再加0、8 ml乙醚,混匀、取0。7 ml加入溶液(１)中(磷有毒且易燃,操作请带手套,多余的磷溶液用CuSO４进行中和)。 室温下轻轻摇匀15　mｉn,然后加热沸腾并保持5 min,自然冷却、 3、柠檬酸三钠法制备12—30 nｍ胶体金(Ｆrens, 1973) 取2５0 ml三角瓶一个,加１００ ｍl双蒸水及１ ml 1%氯化金,加热沸腾; 柠檬酸钠(mｌ)胶体金(nm)5 柠檬酸钠(mｌ) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 ２4 2、８ 30 注 意: 由于使用试剂质量及其它方面估计存在的误差,以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大小及一致性与理论值估计有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清楚等问题,须重新制备。 胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存1—２个月。但决不可保存在0℃以下,否则金粒子发生凝聚。 二、蛋白—金复合体的制备 一般认为胶体金粒子表面为一层AuＣｌ2,因此,粒子表面带有负电荷,这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮的胶体金溶液、 金颗粒表面能够包被一层生物大分子(如蛋白)来稳定和保护这些粒子,以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于ｐH值,这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值,在pH=pI时为中性。由于在pH＝pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水的金粒子表面、但在实际的胶体金探针制备中,一般胶体金调整为p