GA_T 1965-2021CN 法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法.docx

ICS CCS 13.310 A 92 中华人民共和国公共安全行业标准 GA/T 1965—2021 法庭科学 硅藻 rbcL 基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 Forensic science—Methods for detection of rbcL gene of diatom— Capillary electrophoresis and fluorescence method 2021-10-14发布 2022-05-01 实施 中华人民共和国公安部 发 布 I GA/T 1965—2021 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会(SAC/TC 179)提出并归口。 本文件起草单位：广州市刑事科学技术研究所、中山大学、广东省公安厅。 本文件主要起草人：刘超、徐曲毅、刘宏、赵建、肖成、李越、汪冠三、刘长晖、杨幸怡、徐际超。 1 GA/T 1965—2021 法庭科学 硅藻 rbcL 基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 1 范围 本文件规定了法医物证检验水中尸体组织中硅藻的材料准备、操作方法、聚合酶链式反应(Poly- merase chain Reaction,PCR)扩增硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因特异片段和实时荧 光定量检验结果判定及注意事项。 本文件适用于法庭科学检验中对硅藻rbcL 基因片段的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GA/T 382—2014 法庭科学 DNA 实验室建设规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 rbcL 基因 rbcL gene 叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因。 4 原理 在溺死过程中，肺泡-毛细血管屏障损伤导致水中的浮游生物(如硅藻)随溺液进入血液循环，从而 到达人体内各器官。检测这些浮游生物的存在，可用于诊断溺死。溺死相关硅藻(舟形藻、菱形藻、小环 藻、变异直链藻、针杆藻、骨条藻等)的叶绿体中含有 rbcL 基因，该基因片段与人类及共生菌没有同源 性。在水中尸体的体循环器官(肝脏或肾脏)中检测到该基因的特异片段，可证实溺死相关硅藻脱氧核 糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)的存在。 5 仪器设备 包括： a) 可调微量移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL); b) 高速台式冷冻离心机，可控温至4℃且离心速度可达12000 r/min 以上 c) PCR 扩增仪； d) 实时荧光定量 PCR 扩增仪； e) 毛细管电泳仪； 2 GA/T 1965—2021 f) 超净工作台； g) 高压灭菌锅； h) 涡旋仪。 6 试剂耗材 6.1 DNA 提取试剂，以 Powersoil土壤DNA 提取试剂盒为例： a) 细胞裂解液，常温保存； b) 石英砂，常温保存； c) 20 mg/mL蛋白酶K,4℃ 保存； d) 抑制因子去除溶液，常温保存； e) 蛋白沉淀溶液，常温保存； f) DNA 结合盐溶液，常温保存； g) 硅膜离心纯化柱，常温保存； h) 乙醇冲洗液，常温保存； i) DNA 溶解液，常温保存。 6.2 参考 SYBR Green实时荧光定量 PCR 扩增试剂及引物： a) rbcL(F):5CTCAACCATTCATGCG 3; b) rbcL(R):5CTGTGTAACCCATAAC 3; c) SYBR Green PreMix荧光染料预混酶：5 U/μL,-20 ℃保存。 6.3 参考PCR-CE 扩增电泳试剂及引物： a) rbcL(F):5FAM- CTCAACCATTCATGCG 3; b) rbcL(R):5CTGTGTAACCCATAAC 3; c) PCR PreMix Taq 酶；5 U/μL,-20℃ 保存； d) 甲酰胺； e) 分子量内标(75 bp～500 bp); f) POP-4 胶； g) 纯水； h) 透明薄壁 PCR 管(0.2 mL); i) 96孔微孔板； j) 离心管(0.5 mL 和 2 mL)。 7 实验室环境要求 符合GA/T 382—2014 的要求。 8 操作步骤 8.1 样本准备 8.1.1 剪取尸体的肺、肝、肾样本各0.5g, 加入600μL DNA提取裂解液，