NY_T 2288-2021CN 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法.docx

ICS CCS 65.020 B 16 NY 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 NY/T 2288—2021 代替 NY/T2288—2012 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫 检测与鉴定方法 Detection and Identification method of Cucumber green mottle mosaic virus 2021-05-07 发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I NY/T 2288—2021 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替NY/T2288—2012 《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法》,与 NY/T 2288—2012 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： a) 逆转录聚合酶链式反应检测法反应体系运用的引物修改为更为灵敏的CGMMV-654F/CGM- MV-654R 引物序列(上游引物 Primer F:5-CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3;下游 引物 Primer R:5-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3); b) 修订了结果判定逻辑顺序，调整为典型症状初步判断，快速检测高度疑似，酶联免疫吸附测定法 和逆转录聚合酶链式反应检测法最终判定； c) 增加了档案保存章节及要求； d) 修订了样品取样量的规定，区分了果实和叶片的取样量。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种植业管理司提出。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)归口。 本文件起草单位：全国农业技术推广服务中心、沈阳农业大学、辽宁省绿色农业发展中心、四川省农业 农村厅植物检疫站、四川农业大学。 本文件主要起草人：王福祥、王晓亮、吴元华、夏子豪、毕馨月、蔡明、江冬、郭迪金、李小松、何珊、尚静。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： ——2012年首次发布为NY/T 2288—2012; ——本次为第一次修订。 NY/T 2288—2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法 1 范围 本文件规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒的取样方法、检疫检测、结果判定和报告、样品处理和档案保存。 本文件适用于农业植物检疫中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疫检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB 15569 农业植物调运检疫规程 GB/T 28071/ 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 黄瓜绿斑驳花叶病毒 Cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV),属烟草花叶病毒属，随种子、 接穗、砧木等传播。该病毒病检疫检测与鉴定的重要依据是典型症状及其他快速诊断，结合病毒双抗体夹 心酶联免疫吸附(ELISA) 检测结果或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 结果综合判定。 5 试剂与材料 碳酸钠(Na?CO?)、 碳酸氢钠(NaHCO?)、 无水磷酸氢二钠(Na?HPO?)、 无水磷酸二氢钾(KH?PO?)、 氯化钠(NaCl)、 氯化钾(KCl)、 氯化镁(MgCl?)、 无水亚硫酸钠(Na?SO?)、 氢氧化钠(NaOH)、 叠氮化钠 (NaN?), 乙 醇(CH?CH?OH)、 对硝基苯磷酸二钠(PNPP)、 焦碳酸二乙酯(DEPC)、 去离子水、市售抗体、 市售酶标抗体、市售PCR 试剂、市售Trizol试剂等。检验中所需试剂配比见附录 A。 所有试剂均为分析纯。 6 仪器及用具 PCR 仪、台式高速冷冻离心机、分光光度计、电子天平、酶联板、酶联读数仪、酶免洗板机、微量加样 器、水浴锅、电泳仪及水平电泳槽、凝胶成像系统、培养箱、冰箱等。 7 取样 7.1 种子 取样数量与方法按GB15569 的规定进行，取样要充足，具有代表性。 7.2 叶片及果实 随机选取发病或疑似发病叶片或果实，以幼嫩叶片和果实为主。每份果实样品不少于200 g,叶片不 少于10g,装入自封袋中密封4℃保存，并注明植物名称、采集时间、地点、采集人等信息。 8 检测 8.1 症状检查 检查叶片、果梗、果实，与黄瓜绿斑驳花叶病毒病的典型症状进行比较(见附录B)。 2 NY/T 2288—2021 8.2 快速诊断 快速诊断试纸条或诊断试剂盒检测法见附录C。 如采用市售的