NY_T 3640-2020CN 葡萄品种鉴定SSR分子标记法.docx

ICS 65.020.01 B 05 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 NY/T 3640—2020 葡萄品种鉴定 SSR 分子标记法 Identification of grape cultivars using SSR markers method 2020-07-27 发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3640—2020 目 次 前言 Ⅱ 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 原理 1 5 仪器设备及试剂 1 6 溶液配制 1 7 引物相关信息及使用 1 8 参照品种及其使用 2 9 操作程序 2 10 判定方法 4 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂 5 附录B(规范性附录)溶液配制 7 附录C(规范性附录)30对引物名单及序列 9 附录D(资料性附录)引物相关信息 11 附录 E(资料性附录)参照品种名单及来源 13 T Ⅱ NY/T 3640—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所、农业农村部科技发展中心。 本标准主要起草人：姜建福、刘崇怀、樊秀彩、张颖、孙海生、卢新、李民、李贝贝、焦健。 1 NY/T 3640—2020 葡萄品种鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列(Simple scquence repeat,SSR)分子标记法进行葡萄(Vitis L.)品种 鉴定的术语和定义、原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物相关信息及使用、参照品种及其使用、操作程序 和判定方法。 本标准适用于葡萄品种的 SSR 分子标记鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 2563 植物新品种特异性、 一致性和稳定性测试指南 葡萄 NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA 分子标记法 总则 3 术语和定义 NY/T 2594界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 核心引物 core primers 品种鉴定中优先选用的一套SSR 引物，具有多态性高、重复性好等综合特性。 3.2 扩展引物 extended primers 品种鉴定中备用的一套SSR 引物，具有重复性好、分布均匀等综合特性。 3.3 待测样品 test sample 送检单位提供的待鉴定的葡萄种质、品系、品种。 4 原理 简单重复序列(SSR) 广泛分布于葡萄基因组中，不同品种间每个 SSR 位点重复单位的数量可能不 同。针对每个SSR 位点两侧序列高度保守的特点，设计一对特异引物，利用PCR (聚合酶链式反应，Poly- merase chain reaction)技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR 位点重复单位的数量不同，经 过扩增产生不同长度的片段，在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此， 根据SSR 位点的多态性，利用PCR 扩增和电泳技术可以鉴定葡萄品种。 5 仪器设备及试剂 见附录 A。 6 溶液配制 见附录 B。 7 引物相关信息及使用 引物名单及序列见附录 C,引物等位变异等相关信息参见附录 D。 2 NY/T 3640—2020 8 参照品种及其使用 参照品种的名称及来源参见附录E。 在进行待测样品等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的 PCR 扩增产物的检测。 注1:同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照 品种核对，确认无误后使用。 注2:对于附录E 中未包括的等位变异，应按本标准方法，通过使用DNA 分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小。 9 操作程序 9.1 样品制备 试验样品为葡萄的幼嫩叶片，每份样品中至少随机抽取3个单株，进行混样分析。当一致性结果较差 时，进行单独取样分析。 9.2 DNA 提取 a) 称取葡萄幼嫩叶片0.25g,放入-20℃预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨多次，至粉末状后，立即 装入2mL 离心管中，依次加入1.5 mL 预热(70℃)的2% CTAB 提取缓冲液、45μLβ-巯基乙 醇，充分摇匀。 b) 65℃恒温水浴1h,