DB64 1203_2016  枸杞品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.docx

ICS 65.020.02 B 05 DB64 宁 夏 回 族 自 治 区 地 方 标 准 DB64/T 1203—2016 枸杞品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 2016-12-28发布 2 0 1 7 - 0 3 - 2 8 实 施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 I DB64/T 1203—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由宁夏回族自治区林业厅提出并归口。 本标准起草单位：宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所、国家枸杞工程技术研究中心。 本标准主要起草人：安巍、尹跃、赵建华、曹有龙、李彦龙、戴国礼、何军、焦恩宁、王亚军、 樊云芳、张曦燕、梁晓婕。 1 DB64/T 1203—2016 枸杞品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列 (Simple sequence repeats,SSR)分子标记进行枸杞品种DNA指 纹鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。 本标准适用于枸杞SSR标记分子数据采集和品种鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 19557.1—2004 植物新品种特异性、 一致性和稳定性测试指南总则 NY/T 2558—2013 植物新品种特异性、 一致性和稳定性测试指南枸杞 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 特定引物 本文件中所指引物专门适合于枸杞 SSR 扩增的引物。 3.2 参照品种 具有所用 SSR 位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪 器设备的系统误差。 3.3 待检样品 送检单位提供的待鉴定的枸杞种质、品系、品种。 4 原理 SSR 广泛分布于枸杞基因组中，不同枸杞品种每个 SSR 位点重复基元重复次数可能不同。设计特 异性引物对SSR 进行聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)扩增，扩增产物的片段长度通 过毛细管电泳技术，或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色加以区分。不同的枸杞品种间遗传组成存 在差异，某些SSR 位点重复次数不同显示不同条带，从而实现品种差异鉴定。 2 DB64/T 1203—2016 5 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A。 6 溶液配制 溶液配制方法见附录B。 7 SSR 特定引物 引物相关信息见附录 C。 8 参照品种及其使用 参照品种见附录 D。 在进行等位变异检测时，应同时包括参照品种的PCR 扩增产物。 注1:同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原 参照品种核对，确认无误后使用。 注2:对于附录C 未包括的等位变异，应按本标准方法，重新设计引物，确定大小。 9 操作程序 9.1 样品准备 试验样品为待测枸杞样品和参照品种的组织。参照品种采用3个以上重复，同时进行分析。 9.2 DNA 提取 DNA 提取方法及步骤如下： a) 选取100mg 枸杞组织置于2mL 离心管中，加液氮研磨至粉末； b) 离心管中加入800μL 预热(65℃)2% CTAB 提取液，轻摇混匀； c) 65℃ 水浴1h, 期间每隔10min 轻摇1次； d) 冷却至室温后加入800 μL 氯仿：异戊醇(24:1),混匀20 min; e) 10000 rpm 离心10 min; f) 吸取200 μL 上清液移到1.5mL 的离心管中，加入600 μL 预冷的异丙醇，混匀后置于4℃沉淀 1h 或-20℃ 30 min; g) 10000 rpm 离心10 min; h) 弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤3次，自然晾干； i) 加入100μL ddH2O,1μL RNAase,37℃水浴30 min; j) 待充分溶解后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的浓度和纯度； DNA 原液-20℃保存备用。 注：以上为推荐的一种DNA提取方法。所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。 3 DB64/T 1203—2016 9.3 PCR 扩增 9.3.1 SSR 引物 使用的特定引物及其序列见附录C。 9.3.2 反应体系 利用变性聚丙烯