家畜繁殖学课件-配子与胚胎生物工程.pptVIP

2）、荧光引导去核法：用Hoechst 33342（2～8mg/ml）染色10～15min，然后，在荧光显微镜下确定核的位置。 4）、离心去核法：根据细胞核的密度大于细胞质，用离心的方法可使没有透明带的卵母细胞核被甩向一侧而最后脱离卵母细胞。 5）、化学试剂去核法：用化学试剂处理处于第一次减数分裂中期的小鼠卵母细胞，使染色体相互紧密结合，形成染色体复合体，在卵母细胞排出PB1时，染色体复合体随PB1一起排出。 6）、末期去核法：激活处理成熟卵母细胞，使其排出PB2，然后吸取其周围附近的细胞质。 7）、吸引法去核：在注入核供体的同时吸引除掉原有卵母细胞核。 8）、挤压法去核：在PB1附近，将透明带切开，调准切口，固定卵母细胞，使切割针与其成垂直方向，向下挤压除去PB1连同下面的一小部分细胞质。 B-超 活 采 仪 B超活体采卵 活体采集的牛卵母细胞 3、卵母细胞的体外成熟（IVC） 1）、培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199。培养时尚要加入一定的血清和激素。 2）、温度和气相：牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为38～39℃。所有哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5％C02的空气和最大湿度的环境。 3）．培养时间： 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22～24h，而马为30～36h，猪为40～44h。 4）．培养方法：卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴法、封闭法和开放法三种。 CO2培养箱 （二）卵母细胞的体外受精（IVF） 1、精子的制备：悬浮法（swim up）；直接离心法；哌可（Percoll）密度梯度离心法 2、精子获能处理：肝素处理法；钙离子载体法；高渗溶液处理法 3、受精液：通常使用Tyrode’s改良液和BO液 4、受精方法：微滴法、四孔培养板法 5、精卵共培养的时间、温度和气相：受精后，卵母细胞应立即放入温度39℃，含5％CO2的空气和最大相对湿度的CO2培养箱中培养24～44h，其中牛22～24h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培养18～33h。受精后40～44h检查受精卵的分裂率 （三）早期胚胎的体外培养（IVC） 1、培养液：基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物和蛋白质等。 2、胚胎体外培养系统：常规培养系统、输卵管离体培养系统、与体细胞共培养系统。 3．培养方法：卵子在受精24h后，转移到预先制备好的颗粒单层中继续培养。一般使用微滴培养法。 4、培养的温度和气相环境：和卵母细胞成熟的条件一样。 5．胚胎的回收及其质量评定：以牛为例，整个体外受精程序，从卵母细胞成熟培养开始，经过体外受精和体外培养直至受精卵发育到囊胚阶段，一共经历8d的时间。如定受精当天为0d，则受精后第5～6d即可回收桑椹胚，第7～8d回收囊胚。  1--cell 2--cell 4--8cell 桑椹胚 囊胚 体外受精 体外培养 三、家畜体外受精技术的发展现状和存在的问题 （一）发展现状 动物 卵裂率 囊胚率 冷冻后存活率 鲜胚移植后的产仔率 牛 ８０％－９０％ ４０％－５０％ ８０％ ３０％－４０％ 羊 ８０％－９０％ ３０％－４０％ ８０％ ５０％ 猪 ９０％ ６０％－７０％ － ５０％ （二）存在的问题和发展方向 1、存在的问题 １）囊胚发育率低，细胞数少。 ２）产仔率低，胎儿初生重高。 2、发展的方向 １）深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理； ２）加强腔前卵泡的培养研究，充分利用优良母畜的遗传资源； ３）加强体外受精与其他生物技术的结合。 四、辅助受精技术 (assisted fertilization) 透明带下注射(Subzonal injection,SUZI) 透明带钻孔(Zona drilling, ZD) 活精子 透明带部分切口(Partial zona dissection, PZD) 卵母细胞质内注射(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 这些通过对哺乳类配子进行显微操作以协助其受精的技术称为显微受精。 精子显微注射体外受精技术 Intracytoplasmic Sperm Injection: ICSI 显微受精技术在动物受精和发育机理研究、畜牧业生产及人医临床实践中有着广阔的应用前景： 精液的利用率可成百万倍的提高，可以使优良种公畜得到最充分的应用； 精子的保存技术将大为简化，将来或许只要精子核物质完整就可以达到受精的目的，这对世界珍稀动物资源的保护将产生深远的影响； 与其他技术结合，如将已经过性别鉴定的精子注入卵子受精，可人为控制家畜后代的性别。 第三节