蛋白质的分离提取方法.pptxVIP

第1页/共31页蛋白质的分离提取方法第2页/共31页学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。第3页/共31页一、凝胶色谱法（分配色谱法）⑴.概念： 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。第4页/共31页⑵.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程第5页/共31页⑶.凝胶色谱法的原理—分子筛效应： 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。▲依据的特性是：蛋白质分子量的大小。第6页/共31页凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第7页/共31页二、缓冲溶液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液。2.缓冲溶液的组成举例：H2CO3 —— NaHCO3、CH3COOH —— CH3COONaNaH2PO4 —— Na2HPO4、KH2PO4 —— K2HPO43.缓冲溶液的配制第8页/共31页三、电泳：⑴.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。琼脂糖凝胶电泳示意图第9页/共31页血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳第10页/共31页⑵.电泳原理： 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。⑶.常见电泳类型：①琼脂糖凝胶电泳迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。②聚丙稀酰胺凝胶电泳电泳迁移率完全取决于分子的大小。③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳第11页/共31页课外拓展：用SDS测定蛋白质分子量的方法 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。第12页/共31页实践训练1.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是( ) A.糖类化合物B.脂质 C.蛋白质D.核酸2.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是( ) A.蛋白质分子所带的电荷B.蛋白质分子的形状 C.蛋白质分子的相对质量D.缓冲溶液的pHAC第13页/共31页3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是( ) A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C.将酶或细胞固定在凝胶中 D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是( ) A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高 C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷AC第14页/共31页四、实验操作——血红蛋白的提取和分离1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。第15页/共31页水 分白细胞血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血浆血小板固体物质血液红细胞（最多）血细 胞思考血液有哪些成分？两个α—肽链血红蛋白两个β—肽链四个亚铁红素基团第16页/共31页两个α—肽链血红蛋白两个β—肽链四个亚铁红素基团血红蛋白的特点：第17页/共31页㈠.蛋白质提取和分离步骤样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定㈡.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤1.样品处理：思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。第18页/共31页(1)红细胞的洗涤:①洗涤操作：柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤