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酶联免疫吸附剂测定免疫学术语 01原理实验设计思路和基本步骤结果判断分类方法进展疑难解析目录0305020406 基本信息酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）为免疫学中的经典实验，本词条从定义、基本原理、分类方法、操作要点等方面对其进行了详细介绍。 原理 原理酶联免疫实验洗板工具1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。酶联免疫吸附剂测定 分类方法 分类方法常用的ELISA可以分为以下五大类：①直接ELISA；②间接ELISA；③夹心ELISA；④竞争ELISA；⑤竞争抑制ELISA。其他的ELISA都隶属于这五类ELISA或由这五类ELISA组合衍生。 ?1．直接ELISA其方法是将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。直接ELISA操作很简单，步骤也比较简练，但是其应用范围还是非常有限的，一个重要的原因是这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其灵敏度不是很高；另外，其测定的对象也非常有限，只能测定酶标记的分子。2．间接ELISA间接ELISA与直接ELISA不同的是，间接ELISA中与包被好的抗原结合的是非酶标抗体，另外再引入第二种抗体（即二抗）。二抗是经过酶标的，它可以与第一种抗体特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。由于二抗一般为多抗，因此，一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时，一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时，信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。另外，由于二抗制备比较容易，而且很早就开始商品化，所以操作者无需要将一抗进行酶标，大大缩减了工作量。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中，间接ELISA都是非常重要的实验过程，在临床诊断中，间接ELISA也是检测标志性抗体的重要手段。 实验设计思路和基本步骤 夹心法竞争法间接法实验设计思路和基本步骤 夹心法夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为： 间接法间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： 竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。 进展 进展酶联免疫吸附剂测定亲和素是一种糖蛋白，一分子亲和素可以与四个生物素小分子发生专一亲和作用，类似抗原与抗体亲和。它们之间的作用力是已知最强的非共价作用。80年代后，随着生物素-亲合素系统（BAS）作用被发现，这一亲和作用被结合应用到ELISA技术上，大大提高了后者反应的灵敏性与专一性。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。 结果判断 结果判断定性测定抗体技术。a.一般方法；b.ELISA；c.免疫印迹 ?定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出有或无的简单回答，分别用阳性、阴性表示。阳性表示该标本在该测定系统中有反应。阴性则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔