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第 四 节 DNA限制酶切反应和 限制酶谱绘制 ;一．DNA的限制酶反应 1. 酶单位定义: 使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。 2. 酶切反应类型 1) 完全酶切 SV40(5243bp) pBR322(4363bp) 2) 部分酶切 3. 酶切反应最适条件 1) DNA分子的组成 i. 碱基组成与排列方式 ii. 识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍（如λ中的EcoRI位点） 2) 反应条件 ???????????i. DNA溶液的纯度和浓度（反应浓度）; ii. 限制酶的纯度和稳定性 i) 纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii) 稳定性：保存和反应 iii. 反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液，不同温度下的pH值 iv. 反应温度：大多数为37℃ v.?双酶切和多酶切反应 同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者--分别酶切。 i) 第一种酶切 电泳检查 酚/氯仿纯化 第二种酶切。 可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。 ii) 采用低浓度盐缓冲液的限制酶切 电泳检查 采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。 假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。 如SmaI-BamH(c), BamHI-SmaI(p);二、限制酶图谱的绘制 1. 完全酶切作图法 1）单酶切作图法 一长度为5Kb的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。 i. 单酶部分酶切：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。 ; ii. 末端标记完全酶切 DNA片段 末端标记 完全酶切 凝胶电泳 EtBr染 色观察 放射自显影 ;分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图 根据上述的原理和步骤，前述的5 Kb片段酶I与酶II的定位结果可用两种方法之一： i) 单酶切 分离DNA片段 第二种酶切 凝胶电泳 ii)单酶切 第二种酶切 凝胶电泳 *如果要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时，单酶完全酶切作图就没必要了。 ; 2. 末端标记-部分酶切作图法（Smith-Brinstiel法） ;单端标记方法1 人工合成单端标记法;单端标记方法2 限制酶切单端标记法; 3. 末端标记双相作图法 方法2仍存在两个不足之处：①酶1的选择不能靠近DNA中央；②需先分离DNA片段，该法可克服上述缺点。 现假设有一片段长10 Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:;4. Bal31顺序酶解作图法 DNA片段 Bal31处理不同时间取样终止反应 限制酶切 凝胶电泳 染色观察结果;6. 大尺度限制酶作图 1) 条件 i.??? 电泳方法脉冲场凝胶电泳 ii.?? 样品制备原位DNA制备和酶解 iii.??人工染色体构建pYAC载体构建 iv.??脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG序列存在 2) 一般作图程序