微生物实验三.pptxVIP

微生物实验三第1页/共47页第2页/共47页注意！ 本次实验部分涉及生物危险(粪便中致病微生物)，请谨慎操作(无菌操作)！第3页/共47页内 容 提 要 一 肠道杆菌的鉴定（2学时） 革兰染色（1片/人），双糖铁培养 基接种（8支/室），玻片凝集试验（1片/人） 二 药敏试验（0.5学时） 介绍及展示示教平板 三 抗酸染色（2.5学时） 示教，1片/人第4页/共47页一 肠道杆菌的鉴定（2学时）第5页/共47页采集标本增菌培养分离培养革兰染色革兰染色接种琼脂斜面纯培养生化试验血清学试验动物试验观察菌落特征分析鉴定病原菌的检验程序第6页/共47页1.细菌的生化反应概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验。意义：是鉴别细菌的重要依据。第7页/共47页糖发酵试验甲基红试验碳水化合物代谢试验V-P试验生化反应IMViC试验碳源和氮源利用试验枸橼酸盐利用试验吲哚试验蛋白质和氨基酸代谢试验硫化氢试验各种酶类试验抑菌试验第8页/共47页糖发酵试验[原理] 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。第9页/共47页[方法] 取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37℃温箱培养18－24小时，观察结果。 [结果]1、确定细菌是否生长2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“　”表示。4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。 第10页/共47页大肠杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌葡萄糖 +乳糖 - -第11页/共47页硫化氢产生试验 [原理] 某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。[方法] 分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌至两管双糖铁培养基中。37℃孵育24小时后观察结果。第12页/共47页[结果] 沿穿刺线部位呈黑褐色，表明有硫化氢产生，为阳性以“+”表示， 不变色者为阴性，以“-”表示。 大肠杆菌：- 伤寒杆菌：+第13页/共47页2.肠道杆菌的鉴定实验目的： 熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程第14页/共47页肠道杆菌的鉴定程序粪 便→增菌培养（必要时） ↓ SS 培养基 ↓ 双糖铁培养基┒ ↓ ↓ 生化反应血清学鉴定←┛已完成革兰染色第15页/共47页（1）观察SS平板上菌落特点大肠杆菌在SS平板上的菌落特点；伤寒杆菌在SS平板上的菌落特点； SS平板大肠杆菌粉红色大菌落痢疾杆菌 无色细小 半透明菌落伤寒杆菌无色细小 半透明菌落第16页/共47页（2） 双糖铁培养基接种双糖铁培养基成分含有乳糖和葡萄糖：产酸产气含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀酚红指示剂： 酸：黄 碱：红第17页/共47页各菌的生长特点1)大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色并有气泡。2) 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。第18页/共47页双糖铁培养基接种方法 将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜面 ），37度培养24小时，第二天观察结果。第19页/共47页双糖铁培养基上各菌的生长现象大肠杆菌黄色有气泡伤寒杆菌上红下黄中间有黑色沉淀福氏痢疾杆菌上红下黄第20页/共47页（3）革兰染色方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色（95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸吸干 1min1min冲洗冲洗30s30s冲洗冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果第21页/共47页（4）伤寒杆菌玻片凝集试验原理： 当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。第22页/共47页试剂与器材沙门氏菌属A—E群多价O血清，SS平板上菌落，玻片、消毒缸、酒精灯，记号笔等。方法 1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用移液枪分别在