提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定.pptxVIP

提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定;实验三 提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定—SDS;一、实验目的;二、实验原理;影响电泳的主要因素 ;（4）离子强度：溶液的离子强度一般在 0.02～0.2mol/kg之间电泳较合适。 若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。 其原因：带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。这种静电作用的结果，导致颗粒泳动速度降低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH值变化而影响泳动的速率。 （5）溶液粘度：泳动度与溶液粘度是成反比例关系。因此，粘度过大或过小，必然影响泳动速度。;;（7）焦耳热：电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当电流强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。 （8）筛孔：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。 除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。;;;;光聚合： 以光敏感物核黄素(即VB2)作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。 光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。 采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。 ;;;凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 ;;;;;;;电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。 在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后面，成为慢离子(尾随离子)。 这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的接口。 在 pH6.7条件下带有负电荷的样品，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐渐形成一个区带。 ; 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。;图5 不连续系统浓缩效应示意图 ;在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根 有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度 由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，及低电导区。 电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系： V=I/S ;在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高的电位梯度， 使样品和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。 在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。 这就是浓缩效应。 ;;;;;;Lg MW =－b ? m R + K;;;;Gel;;;;;;实验试剂配制 ;(5) 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8): 取6g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液40mL，调pH至6.8，定容至100mL( Tris为三羟甲基氨基甲烷或缓血酸铵)。 (6) 10%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液: 取5g SDS加水定容至50mL。（加热溶解） (7) 电极缓冲液(0.1%SDS–0.05mol/L Tris–0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸(氨基乙酸)和