核酸分子杂交工程.pptVIP

电转移 现在主要使用带电荷的尼龙膜作为电转移的DNA支持载体 完全转移所需的时间取决于： DNA片段的大小 凝胶的孔隙度 外加电场的强度 真空转移 使用真空转移装置 可快速并定量转移 NC膜或尼龙膜均可 真空印迹系统(Bio-Rad) 10×SSC 转移缓冲液 Whatman滤纸 凝胶 Whatman滤纸 纸巾 玻璃板 重物 支持物 500g NC膜或尼龙膜 毛细管转移 Whatman滤纸 凝胶 杂交膜 封口膜(parafilm) Whatman滤纸 纸巾 液流向下的毛细管转移装置示意图 核酸分子杂交工程 用一已知的DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 核酸分子杂交的基本原理 　　具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的条件（温度及离子强度）下可以按碱基互补配对的原则退火形成双链分子，由此可用来检测核酸分子存在与否。 实质是核酸分子的变性与复性过程 基因克隆的筛选 酶切图谱的制作 基因组中特定基因序列的定量和定性分析 基因突变分析 疾病的诊断 核酸分子杂交应用 探针(probe)的概念 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段 第一节 核酸探针及其标记 一、核酸标记物及其选择 探针的种类 寡核苷酸探针 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 高度灵敏性 标记物与核酸探针分子的结合，不影响探针的主要理化特性，绝对不能影响其碱基对特异性 具有较高的化学稳定性，能耐较高温度和保存时间 检测方法具有高度特异性 标记及检测方法简单 对环境无污染，对人体无损伤 价格低廉 理想探针标记物应具备的条件 灵敏度极高 放射性核素对各种酶促反应无任何影响,也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质 极高的特异性 1. 放射性核素-----目前最常采用 优点 缺点 半衰期短, 随用随标 放射性污染 无放射性污染 稳定性好,可较长时间存放 2. 非放射性标记物 优点 缺点 灵敏度不太高 特异性不太高 生物素 地高辛 荧光素：FITC，罗丹明 非放射性标记物 生物素化核苷酸的制备:酶法(U)与化学法(C) 生物素标记方法:参入标记法(随机引物法或缺口翻译法)与光敏生物素标记法 生物素探针的检测体系 ①生物素探针+抗生物素蛋白+带ALP或HRP的生物素+底物 ②生物素探针+抗生物素抗体+抗生物素抗体的抗体+ABC试剂(底物:BCIP+NBT) 探针DNA标记:Dig+dUTP→ Dig-dUTP Dig-dUTP标记DNA方法: 切口平移法与随机引物标记法 检测方法: Dig-DNA探针+抗Dig抗体-ALP或HRP+底物（BCIP+NBT） 二、核酸探针的标记方法 DNA的切口平移标记法 随机引物标记法 RNA探针的标记 DNA的末端标记 cDNA探针的标记 寡核苷酸探针的标记 1. DNA的切口平移标记法 5 ′ 3 ′ 3 ′ 5 ′ 32P-部分标记的单链DNA片段 切口原始位置 切口最终位置 32P-标记的DNA 双链DNA 带切口的双链DNA DNA聚合酶I [α-32P]-dCTP 变性 DNase I，Mg2+ dATP，dGTP，dTTP 5 ′→3 ′外切 1. DNA的切口平移标记法 方法原始出处： Rigby PW, et al. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J Mol Biol, 1977,113(1):237 ～251. 2. Koch J, et al. An improved method for labelling of DNA probes by nicktranslation. Nucleic Acids Res, 1986,14(17):7132. 1. DNA的缺口平移标记法 反应体系 变性模板 1 μg DNase I 大肠杆菌DNA聚合酶I dATP，dGTP，dTTP [α-32P]-dCTP， 50μci/反应 总体积：50μl 15 ℃ ，60min; 95～100℃，2min冰浴骤冷 比活： ＞ 1×108cpm/μg 2. DNA的随机引物标记法 5 ′ 3 ′ 3 ′ 5 ′ 32P-标记的单链DNA探针 32P-标记的DNA 双链DNA Klenow DNA聚合酶 [α-32P]-dCTP 变性 dATP，d