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基因工程的基本操作程序新课第1页/共47页第2页/共47页基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第3页/共47页一、目的基因的获取编码蛋白质的结构基因1、目的基因主要是指______________________2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成第4页/共47页(1)从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？第5页/共47页基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）概念：基因文库 （gene library） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)第6页/共47页基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.第7页/共47页基因组文库与部分基因文库的关系第8页/共47页第9页/共47页第10页/共47页基因组DNA文库与cDNA文库的比较cDNA文库基因组DNA文库第11页/共47页第12页/共47页第13页/共47页第14页/共47页（3）如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。第15页/共47页（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR——多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。第16页/共47页PCR技术原理：前提：原料方式DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子如：Mg2+(激活剂)：以_____方式扩增， 即____（n为扩增循环的次数）指数PCR扩增仪2n第17页/共47页利用PCR技术扩增目的基因第18页/共47页延伸变性退火变性、退火、延伸三步曲 过程变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链第19页/共47页PCR(多聚酶链式反应) 第20页/共47页PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第21页/共47页3、人工合成的目的基因目的基因的mRNA1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。反转录单链DNA (cDNA）合成双链DNA(即目的基因)2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：结构基因的核苷酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因推测化学合成推测第22页/共47页(二)基因表达载体的构建—— 核心1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）DNA连接酶第23页/共47页基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子同一种 限制酶一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。第24页/共47页资 料: 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 第25页/共47页基因表达载体的组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因等目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发