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基因诊断肝炎第1页/共22页乙型肝炎 病例第2页/共22页颜先生，男，47岁，在一家大公司任公关部经理。近两个月感觉乏力、纳差，每次应酬都不胜酒力。20天前皮肤及巩膜开始发黄。 到医院检查肝功能显示谷丙转氨酶、谷草转氨酶增高，总胆红素、间接胆红素增高，乙肝表面抗原阳性。诊断为 乙型肝炎公司同事知道颜先生患乙肝后，都对其敬而远之，午餐时颜先生总是形单影只，独自闷头吃饭，与以往呼朋唤友的情形反差甚大。 第3页/共22页乙型肝炎 基因诊断常规检查基因诊断优势乙肝病毒基因组结构基因诊断技术 基本技术重点技术 乙型肝炎 常规检查第4页/共22页乙肝（乙型病毒性肝炎）五项检查乙肝（乙型病毒性肝炎）病毒DNA检测肝功能检查B超甲胎蛋白(AFP)第5页/共22页乙型肝炎 基因诊断优势目前研究发现，许多表面抗原阴性的异型乙肝并不少见，不少乙肝患者虽然只表现为抗体（如核心抗体，e抗体等）为阳性，但是肝功能反复异常，进一步检查乙肝病毒DNA往往为阳性，这些人也是乙肝现症感染者。基因诊断是通过较为先进的检测技术（例如聚合酶链反应）检测出体内极其微量的乙肝病毒DNA基因，是一种新的检验方法。乙肝病毒DNA是乙肝病毒复制的发动机。乙型肝炎 基因组结构第6页/共22页 双链缺口环型DNA，约3.2kb，分为正、负链。 负链为长链，长度固定；正链为短链，长度可变。在粘性末端各有11bp组成的直接重复（DR）序列，分为DR1和DR2区。乙肝病毒基因组DNA有四个开放读码框架（ORFs），分别为S、C、P和X区，其中P区分别与S、C和X区相互重叠。乙型肝炎 基本技术第7页/共22页核酸电泳聚合酶链式反应（PCR）基因芯片核酸杂交斑点杂交原位杂交DNA印迹和RNA印迹杂交技术乙型肝炎 重点技术第8页/共22页聚合酶链式反应反向斑点杂交生物芯片技术乙型肝炎 重点技术之一第9页/共22页PCR扩增HBV基因特征序列 检测乙肝病毒DNA聚合酶链式反应（PCR）作为一种简便高效的基因扩增技术，具有极高的检测灵敏度和特异性，通过扩增并检测HBV DNA保守区的一段特殊序列而达到对乙肝病毒的检测目的。相对于常规的PCR检测方法，荧光定量PCR克服了假阳性缺点，能对HBV-DNA实时定量测定。PCR扩增HBV 基因特征序列检测乙肝病毒DNA海量PPT模板免费下载乙型肝炎 重点技术之一第10页/共22页PCR检测中的要点引物是决定PCR产物是否特异，反应能否成功进行的关键。设计引物有如下原则 第11页/共22页乙型肝炎 重点技术之一MD24,MD26的介绍：以上引物为X基因中最保守的序列，该引物分别位于乙肝病毒基因组的1400~1423和1627~1610位，扩增产物长度为227bp乙型肝炎 重点技术之一第12页/共22页荧光定量PCR原理示意图乙型肝炎 重点技术之二第13页/共22页反向斑点杂交（RDB）法反向斑点杂交（RDB）具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。本次实验的基本原理是通过PCR扩增将DIG-11-dUTP掺入目的产物，将PCR产物变性后与固定在膜上的寡核苷酸探针进行杂交，然后通过酶免疫显色法获取结果。乙型肝炎 重点技术之二第14页/共22页RDB检测乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子区A1762T/G1764A突变A1762T/G1764A是位于X基因上的位点突变，核苷酸1762位上的腺嘌呤转换成了胸腺嘧啶，A-T突变；1764位上的鸟嘌呤转换成了腺嘌呤，G-A突变。实验步骤：1、确定检测对象5例A1762/G1764病毒株血清2例T1762/G1764病毒株血清5例A1762/A1764病毒株血清4例T1762/A1764病毒株血清第15页/共22页2、引物、探针设计与合成3、检测阵列制备，手工点样探针点样区域第16页/共22页4、PCR扩增5、杂交、洗膜和显色结果：第17页/共22页乙型肝炎 重点技术之三生物芯片技术生物芯片根据检测对象分为：基因芯片和蛋白质芯片优点：缩短肝炎病毒感染窗口期，减少漏检和误检。耗血量少，多指标检测更简便更高效。生物芯片技术采用最先进的技术，准确性好。 乙型肝炎 重点技术之三第18页/共22页生物芯片技术大量特定的核酸片段或蛋白质有序固定在载体上 与待检核酸或蛋白质分子进行反应检测光信号的强弱并判断样本中的靶分子数量 乙型肝炎 重点技术之三第19页/共22页基因芯片原理图乙型肝炎 重点技术之三第20页/共22页基因芯片用于乙肝病毒的耐药性突变检测第21页/共22页Thank you!第22页/共22页感谢观看！