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吾日三省乎吾身。为人谋而不忠乎？与朋友交而不信乎？传不习乎？——《论语》 PCR 技术培训教材 PCR 培训教材 PCR 基础理论 一、半保留复制及转录、逆转录 (1)DNA 的半保留复制(semiconservative replication) DNA 是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传 密码的形式编码在 DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过 DNA 复制 (replication)由亲代传给子代。在DNA 合成进行时，以两条亲代 DNA 链中的每一条链为 模板，在 DNA 指导下的 DNA 聚合酶催化下，按 A 与 T、G 与 C 碱基配对原则合成子代 DNA 的过程称DNA 的复制。由于复制合成的子代DNA 两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代 DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA 链，所以 DNA 的这种合成作用又称半保留 复制(图 1)。 (2)RNA 的转录（transcription）过程 以DNA 为模板合成 RNA 的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA 合成 的主要方式，是遗传信息由DNA 向RNA 传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶 促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖 DNA 的RNA 聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为 RNA 前体 （RNA precursor），它们必须经 过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。 1 PCR 培训教材 RNA 的转录合成从化学角度来讲类似于 DNA 的复制，多核苷酸链的合成都是以 5’→3’ 的方向，在 3’-OH 末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的 目的不同， 转录又具有其特点： （1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基 因的转录都受到相对独立的控制； （2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且 RNA 链的合成是连续的。 转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。 (3)RNA 的逆转录（reverse transcription）过程 以RNA 为模板，根据碱基配对原则，按照 RNA 的核苷酸顺序(其中U 人之为学，不日进则日退，独学无友，则孤陋而难成；久处一方，则习染而不自觉。——《顾炎武》 人不知而不愠，不亦君子乎？——《论语》 与 A 配对)合成 DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为逆转录，催化此 过程的 DNA 聚合酶叫做逆转录酶(reverse transcriptase)。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA 聚合酶活性；以 RNA 为模板，催化 dNTP 聚合成 DNA 的过程。②RNase H 活性；由反转录酶催化合成的 cDNA 与模板 RNA 形成的杂交分子，将由 RNase H 从 RNA5′端水解掉 RNA 分子。③DNA 指导的 DNA 聚合酶活性；以反转录合成的第一条 DNA 单链为模板，以 dNTP 为底物，再合成第二条 DNA 分子。除此之外，有些反转录酶还有 DNA 内切酶活性。反转录酶的发现对于基因工程 技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。�� 二、PCR 技术的基本原理与 PCR 技术的特点 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或体外 酶促基因扩增法。PCR 技术是由Kary B Mullis 于 1985 年联合创造的。该技术可将极微量 的靶 DNA 特异地扩增上百万倍，从而大大提高对 DNA 分子的分析和检测能力，能检测单分 子