《烤烟品种鉴定技术规程 SSR分子标记法》 技术报告.pdfVIP

烤烟品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 技术报告 目 录 1．前言1 2．材料与方法2 2.1 供试材料2 2.2 供试SSR 标记3 2.3 供试材料全基因组DNA 提取3 2.4PCR 扩增及电泳检测3 2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 （PAGE）3 2.6 毛细管电泳5 2.7 数据分析5 3．供试群体遗传的多样性分析5 4．最少引物数评估14 5．构建供试群体的SSR 标记指纹图谱15 6．烤烟DUS分子检测的核心SSR 标记18 7．结论28 附件130 1．前言 植物新品种在农业增产、增效和社会经济活动中起着至关重要的作用，对植 物新品种实施知识产权保护，是当今国际通行的做法和人类文明进步的标志。开 展新品种保护离不开一系列技术条件的支撑，其中新品种的特异性（Distinctness）、 一致性 （Uniformity）和稳定性 （Stability）测试就是植物新品种保护的技术基础 和科学依据。1999年我国正式加入 《国际植物新品种保护公约》，成为国际新品 种保护联盟 （InternationalUnion For TheProtection OfNewVarietiesOfPlants，简 称UPOV）的成员国。随后以UPOV 的DUS测试指南为范本，制定了一系列适 合我国特点的农作物DUS测试指南，并在植物新品种保护方面推广应用。2017 年5 月1 日起实施的《非主要农作物品种登记办法》第十二条明确规定，申请登 记的品种应当具备特异性、一致性、稳定性。在国际上UPOV 于2002 年首先发 布了烟草DUS测试指南，随后我国学者依据 《植物新品种特异性、一致性和稳 定性测试指南 总则》（GB/T 19557.1-2004），同时参考UPOV 的测试指南制定 并发布了我国首个烟草DUS测试标准 《植物新品种特异性、一致性和稳定性测 试指南 烤烟》（YC/T369-2010）。 DUS测试是一个复杂的技术检测过程。目前，我国及国际上通行的新品种 DUS测试标准主要是建立在部分生物学性状 （包括农艺性状、品质性状和抗逆 性状等）的田间测定基础上，如在我国烤烟DUS测试指南中就规定了35个基本 性状，其中16个为必测性状。由于主要以植物的表观形态特征为基础，因此在 对测试品种与标准品种、近似品种进行测定和比较分析时，鉴定结果容易受环境 因素的影响，在测试过程中也经常出现因不同测试人员对性状的认识存在偏差， 导致某些性状代码判定结果不一致的问题，同时巨大的工作量还会进一步加大测 试误差。以分子标记为基础的分子检测技术具有测试周期短、不受环境影响、易 于自动化等优势，是DUS快速测试技术的发展方向。在众多分子标记技术中， SSR (Simple SequenceRepeats) 标记具有数量丰富、稳定重复性好、多态性高、 共显性、操作简单等优点，被认为是植物新品种DUS测试中较理想的标记技术， 已经成功应用于多种农作物标准品种的指纹图谱构建及DUS测试中。因此，本 研究拟针对烟草新品种DUS 测试工作中缺少分子标记检测技术的现状，利用 1 DUS测试标准品种筛选并构建SSR 分子标记指纹图谱，进而形成可用于烟草区 域试验参试品种的特异性鉴定方法，为烤烟新品种的审定和保护提供坚实的技术 基础。 2．材料与方法 2.1 供试材料 本研究所用烤烟DUS测试标准品种 （见表1）由国家烟草种质资源中期库 提供。 表1. 本研究所用烤烟DUS测试标准品种 编号 资源编号 品种名称 资源类型 典型性状 SV01 2290 NC82 引进 椭圆形叶形 SV02 485 小黄金1025 地方 叶数少、黑胫病感病 SV03 1084 G28 引进 叶宽宽、叶长宽比小、宽椭圆形叶形、感CMV SV04 2490 中烟90 选育 纵向叶面急弯、叶面较皱、叶缘皱折 SV05 1365 中烟15 选育 花序密集 SV06 2243 Coke