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实验重组体筛选与鉴定第1页/共81页第2页/共81页重组质粒的转化 转化（transformation)： 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。第3页/共81页转化方法1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；2、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。第4页/共81页重组质粒的转化（热激法）1、冰上融化感受态细胞；2、将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞，冰浴40min；3、42℃热激90s，勿摇动！4、热激后立马放置冰上1-2min；5、加400ulLB液体培养基，置摇床，37℃，70-100rpm 1h；6、涂平板。第5页/共81页 大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定 感受态细胞(competent cells): 受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。 第6页/共81页原理目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源ＤＮＡ分子的受体细胞。 第7页/共81页试剂：1.LB固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mM CaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5. 待转化质粒。 第8页/共81页实验步骤1.挑取一DH5α单菌落于5ml LB培养液中37℃过夜培养 第9页/共81页2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间 第10页/共81页3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟第11页/共81页4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟第12页/共81页5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 第13页/共81页6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。 取其中一份进行转化。第14页/共81页7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。第15页/共81页8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。第16页/共81页9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分钟。第17页/共81页10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟第18页/共81页11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。第19页/共81页四、实验注意事项为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。 第20页/共81页克隆的筛选与鉴定 不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上