转基因的方法和原理.pptVIP

(2)基因枪轰击法 （微弹轰击技术micro-projectile bombardment) 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。 步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。 第三十页，共五十三页，2022年，8月28日 第三十一页，共五十三页，2022年，8月28日 决定基因枪使用成功的因素 第一因素是动力系统。 根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体作为动力。 第二因素是微弹的制备过程 。用的微载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直径一般为0.6－4μm。 常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等。 第三个因素是受体材料的选择。 第三十二页，共五十三页，2022年，8月28日 农杆菌与植物细胞相互作用的机制 第三十三页，共五十三页，2022年，8月28日 土壤农杆菌转化法 第三十四页，共五十三页，2022年，8月28日 农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组. Tumor induced by A. tumefaciens 第三十五页，共五十三页，2022年，8月28日 Ti Plasmid T-DNA region Left border Right border vir genes ori 已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。 auxin 第三十六页，共五十三页，2022年，8月28日 报告基因: Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因） 在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点： ①在一定条件下与X-G1ucuionic acid （5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。 ②当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。 ③检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。 ④价格便宜。 第三十七页，共五十三页，2022年，8月28日 第三十八页，共五十三页，2022年，8月28日 第一页，共五十三页，2022年，8月28日 简介 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。 转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。 第二页，共五十三页，2022年，8月28日 基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆； 第三页，共五十三页，2022年，8月28日 第四页，共五十三页，2022年，8月28日 分离基因 克隆到某中间载体 转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切/连接 克隆到植物表达载体 转化农杆菌 基因枪转化 pKS,pBR332,pGEM-T JM109, TOP10… HindIII/EcroI… T4 ligase pBI121, pCAM1001… LBA4404, EHA 第五页，共五十三页，2022年，8月28日 第六页，共五十三页，2022年，8月28日 目的基因制备和载体系统 目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。 载体：质粒、λ噬菌体 、柯氏质粒 、YAC载体 等 工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶 等 第七页，共五十三页，2022年，8月28日 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。 PCR要求反应体系具有以下条件： 1