生物酶工程的学习材料.pptxVIP

生物酶工程的学习材料;Contents; 生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，亦称高级酶工程(Advanced Enzyme Engineering)。 ;二、 生物酶工程的内容;（4） 抗体酶；; 通过基因工程手段，克隆各种天然酶的基因，将其克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到适当的宿主中，得到表达特定酶的基因工程菌，通过基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶。 ;克隆酶图例; 外源基因转入微生物宿主细胞内，与宿主细胞的遗传物质相结合，后代宿主的遗传物质中含有外源基因，这种带上人工赋予的新的遗传特性的宿主微生物，被称为基因工程菌。;（1）在宿主细胞内可以自主复制；;（3）克隆酶对宿主的要求;（4）克隆酶基因的表达系统; 纤维素酶基因工程菌的构建; 纤维素酶; 为此，通过基因工程技术，克隆福寿螺体内的纤维素酶基因，构建含有cel的基因工程菌，以期通过液体培养或固体培养的方式得到大量的克隆纤维素酶。 ;afp基因;; 定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或稳定性，使之更加符合人们的需要。 ;遗传修饰改变酶的性能大致有： （1）提高酶的活性 （2）提高酶的稳定性 （3）改变底物专一性 （4）改变酶的最适pH值 （5）改变酶对辅酶的要求 （6）改变酶的别构调节能力 ; 修饰酶基因的方法主要方法 （i）定位突变 （ii）体外定向进化 ; 定位突变（site-directed mutagenesis）是根据酶的结构、功能和作用机制的信息，在基因水平上精确改变酶分子中的氨基酸残基，对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶。 ;盒式诱变 寡聚苷酸引物诱变 PCR诱变 ;（1）盒式诱变;;（2）寡聚苷酸引物诱变;A;（3）PCR诱变;原理：在头两轮的PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有同样的突变。故此两条双链DNA片段经变性和退火处理，形成两种不同形式的异源双链分子。然后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，可得到一种含有突变位点的突变体DNA。;;;5’;一．理论来源;第32页/共73页;第33页/共73页; 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶的分子进化技术称为体外定向进化。;定向进化示意图; Strategies for the development of effective enzymes;定向进化;定向进化＝随机突变＋选择;第39页/共73页;;澄清一个事实：定向进化不是定点突变;易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 ;易错PCR;DNA改组;PCR扩增;体外定向进化;成功实例;成功实例;体外随机引发重组;; 交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。 ;第52页/共73页; 定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库; (2) 突变体应能在适当的微生物(如大肠杆菌或酵母菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛选方法,能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。 ;环境库和噬菌体展示库的构建;噬菌体展示库的构建; 在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。; 利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌