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第1页/共57页微生物限方法学验证第2页/共57页 微生物限度检查方法的验证第3页/共57页微生物限度检查方法的验证细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ——准确性（回收率）控制菌检查法的验证——专属性第4页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证的目的： 确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。第5页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证的步骤：根据样品特性，制定检验方法和检验条件。保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。按制定的方法进行试验。根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。第6页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。第7页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。第8页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法。样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。第9页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。第10页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液制备 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。第11页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液制备 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。第12页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。 第13页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ? 菌液组 ? 供试品对照组 ? 试验组 ? 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。第14页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证菌液组：测定所加的试验菌数。平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。第15页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。（和试验组采用同法）第16页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。 第17页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。第18页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张膜。第19页/共57页细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证试验组：离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以低速5