原核生物的基因重组.pptxVIP

第1页/共42页原核生物的基因重组第2页/共42页原核生物的基因重组类型 4种形式：1）转化 2）转导 3）接合 4）原生质体融合第3页/共42页一、 转化（transformation）定义：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段, 并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。 转化子（ transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细胞称为转化子，即转化成功的菌落。 目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。第4页/共42页1. 感受态自然感受态与人工感受态的不同？感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性 （如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期） 受细菌自身的基因控制感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源DNA能力的细胞自然遗传转化（natural genetic transformation）人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）人工转化（artificial transformation）感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。 第5页/共42页进行自然转化，需要二方面必要的条件：（1）建立了感受态的受体细胞（2）外源游离DNA分子第6页/共42页感受态的机理研究：局部原生质体化假说：处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜进入菌体。酶受体假说：受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。第7页/共42页2. 转化模型 （1）转化因子 本质是离体的DNA片断或质粒DNA 。转化因子进入细胞前还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因子的形式不同，dsDNA,ssDNA. 革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNA形式的转化因子，但进入细胞后需经酶解为ssDNA，才能与受体菌的基因组整合； 革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNA的一条链必须在胞外降解，只有ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。 但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。 由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并干扰转化作用。 质粒DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。 转化的频率通常为0.1％～1％，最高为20％。第8页/共42页ds DNA供体(strR)感受态受体(strS)酶解与吸收单链同源区段配对单链整合复制与分离转化子(strR)非转化子(strS)(2) 转化过程 转化因子进入细胞 转化因子单链配对与整合 复制 分离 肺炎链球菌转化的主要过程 第9页/共42页自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA给体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA） 给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化形成转化子效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-------重组获救第10页/共42页4. 转染(transfection)：定义：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入微生物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染第11页/共42页5、人工转化在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。用CaCl2处理细胞，PEG介导、电穿孔、基因枪法等是常用的人工转化手段（使细胞膜更易于透过DNA ）。质粒的转化效率高（不像线型DNA 那样易于降解，而且还能在宿主中复制。任何来源的DNA 将其连接到质粒上都能进入受体细胞）.第12页/共42页二、转导（transduction）转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。 由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子 （transd