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基因敲除的课件资料;基因敲除的概念 基因敲除的发展历程 基因敲除的几种方法 基因敲除的应用前景 基因敲除现存的缺点;基因敲除: 是基因打靶技术的一种。 概念：是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。 切除部分 --- 观察整体--- 推测功能; 1.基因敲除的技术基础：80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功 2. 基因敲除的理论基础：1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在 3. 80年代后半期，DNA同源重组原理发展起来诞生了基因敲除这样一门新技术。 4.到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。 5.直到现在，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。;利用基因同源重组进行基因敲除 条件性基因敲除法 诱导性基因敲除法 利用随机插入突变进行基因敲除 基因捕获法 RNAi引起的基因敲除; 以下两种是新方法： 1.TFOs（Triple helix forming oligonucleotides）引子生物学理导的基因敲除术 2.反义技术在基因敲除技术中的运用;a． 基因载体的构建 b．ES 细胞的获得 c．同源重组 d. 选择筛选已击中的细胞 e．表型研究 f．得到纯合体;;定义:将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。 它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。 ;诱导性基因敲除是利用控制CRE表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将表达系统转移到动物体内的过程在时间的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修之目的的基因敲除技术;此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随???插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 在此方法下，还出现了一种新的方法：基因捕获法;;通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。 中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。 ;;优点： 利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。 缺点： 1.只能剔除在Es 细胞中表达的基因， 2.无法对基因进行精细的遗传修饰。 ;由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除. RNAi基因敲除的应用 1. 研究信号传导通路的良好工具 2. 研究在发育过程中起作用的基因 3.体外培养的细胞中研究一些小鼠在胚胎时就会死亡的基因的功能;①.建立生物模型。 ②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。 ③.提供廉价的异种移植器官。 ④.免疫学中的应用。 ⑤.改造生物、培育新的生物品种。; 随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能。其原因包括：一方面，愈多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型。另一方面对于某些必需基因，敲除后会造成细胞致死性，也无法对这些必要基因进行相应的研究了。;第19页/共20页;感谢观看！