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酵母菌表面展示操作步骤 酵母菌表面展示是一种常见的实验技术，用于研究酵母菌的生长、营养需求、代谢特性以及它们与其他微生物的相互作用等。下面是一系列酵母菌表面展示的操作步骤及参考内容。步骤一：菌种的培养与保存1.1 从冷冻保存的酵母菌培养物开始，取出适量的菌液接种到培养基中，备用。1.2 准备含有20%（w/v）甘油和20%（v/v）甲醇的冷冻液，将酵母菌转移到冷冻液中，短暂混匀后，保存在-80℃的冰箱中。步骤二：构建表达载体2.1 根据需要，选择合适的表达载体（如质粒），进行线性化处理。2.2 为构建目的选择适当的启动子、终止子和标签序列，并根据需要设计引物。2.3 利用PCR或其他适合的方法扩增所需的DNA片段。2.4 将扩增得到的DNA片段与线性化的表达载体进行连接，得到重组质粒。2.5 将重组质粒转化到大肠杆菌等宿主菌中进行扩增。步骤三：酵母菌的转化3.1 选取培养基中的酵母菌，通过离心将菌液收集。3.2 用含有聚乙烯醇（PEG）的转化缓冲液处理酵母菌，使其具有质粒摄取的能力。3.3 加入重组质粒，并通过温育或电穿孔等方法将质粒导入酵母菌细胞内。3.4 将转化后的酵母菌在含有所需营养物的固体或液体培养基上进行培养。步骤四：酵母菌表面展示4.1 筛选酵母菌表面展示的目标蛋白或多肽序列。4.2 设计引物，根据目标序列进行扩增。4.3 将扩增得到的DNA片段连接到具有表面展示功能的载体上。4.4 将构建好的表达载体转化到酵母菌中。4.5 在含有所需营养物的培养基上进行固体或液体培养，获得表面展示目标的酵母菌菌落或液体培养物。参考内容：1. Schreuder MP. Surface Display on Gram-Positive Bacteria. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2018;1671:343-360. doi:10.1007/978-1-4939-7292-7_192. Aoki W, Ueda M. Characterization of surface display system using SpaA pilin derived from a pathogenic spirochete, Treponema denticola. Journal of biotechnology. 2014;184:59-64. doi:10.1016/j.jbiotec.2014.04.0103. Yi L, Liu P, Li L, et al. Surface display of proteins via SUMO fusion in Pichia pastoris for whole-cell biocatalysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 2019;103(14):5807-5819. doi:10.1007/s00253-019-09971-84. Ge L, Yu Y, Zhang M, Chen S, Zhu H. Targeting and display of antigens and enzymes on the surface of Bacillus subtilis spores. Microbial Cell Factories. 2019;18(1). doi:10.1186/s12934-019-1124-25. Sasaki Y, Kimoto T, Mizukoshi H, Akiyoshi K, Kino-oka M. Construction of a surface-displayed whole-cell catabolic biocatalyst using aromatic thermophilic Bacillus sp. THP-1 via the S-layer fusion protein R6-TS adhesion module. Applied Microbiology and Biotechnology. 2017;101(7):2969-2979. doi:10.1007/s00253-017-8139-9