EZH2影响炎症状态下人牙周膜干细胞成骨分化能力的研究.docxVIP

? ? EZH2影响炎症状态下人牙周膜干细胞成骨分化能力的研究* ? ? 王鹏程 田 欢 张 正 王左敏 牙周膜干细胞是从拔除牙齿牙根周组织分离培养而获得的种子细胞，可与支架材料和生长因子复合增殖分化而实现牙周组织再生[1]。在牙周再生治疗过程中，炎症环境会影响PDLSCs 的成骨能力[2]，因此，在炎症环境下改变PDLSCs 的成骨能力显得尤为重要。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要毒力因子，与牙周炎的免疫反应有关[3]，LPS 刺激后的牙周膜细胞可以被诱导产生一系列促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶，它们会导致牙周组织的炎症浸润和组织破坏[4-6]。同时有研究表明，在受到LPS 刺激之后的牙周膜干细胞，其分化、增殖的潜能也会受到影响[7]。LPS 介导炎症发生、降低牙周膜干细胞成骨能力，并且可以刺激牙周膜干细胞来模拟炎症环境[8]。 EZH2 是一种多梳蛋白，通过使组蛋白H3 第27 位赖氨酸(H3K27)三甲基化修饰，达到抑制靶基因转录的作用，进而出现细胞分化和增殖异常，引起一系列疾病的产生。有研究发现，在骨质疏松症动物模型中通过抑制EZH2，可以促进间充质干细胞的成骨分化能力[9]，而EZH2 是否是PDLSCs成骨分化的靶点还不得而知。本研究使用LPS 刺激模拟炎症环境，靶向敲低PDLSCs 中EZH2，检测其成骨能力变化，探讨EZH2 对炎症状况下PDLSCs 成骨能力的影响，以期为临床提供参考。 1.材料与方法 1.1 PDLSCs 的分离、培养与鉴定 选自首都医科大学附属北京世纪坛医院口腔科阻生齿拔除患者中获得健康磨牙(已通过首都医科大学附属北京世纪坛医院医学伦理委员会批准)。分离牙周膜组织，用0.2%胶原酶(Gibco，美国)在37℃处理2h后用0.25%胰蛋白酶消化30min。然后将单细胞悬液在含有100μg/ ml 链霉素(Beyotime，中国)、100U/ ml 青霉素(Beyotime，中国)的α-MEM 培养基(Gibco，美国)中在37℃和5%CO2条件下孵育。将第3-5 代细胞用于后续实验。 取第三代牙周膜干细胞使用PBS 洗1 遍，常规胰酶消化，最终调整细胞密度(1×106/ ml)，分装至无菌EP 管中(1.5mL)。分别加入Alexa Fluor 647、FITC 或PE 直接荧光标记的抗人Stro-1，CD14 和CD45 抗体(Santa Cruz，美国)。利用同型抗体进行对照。冰上避光孵育1.5h，1000rpm 离心3min，小心弃掉上清，应用PBS 洗涤3 遍，加入含3%胎牛血清的PBS 重悬，应用流式细胞仪进行检测。选取对数生长期的牙周膜干细胞，使用胰酶消化之后制成细胞悬液，稀释为1×106、5×106、5×107个/ L 的单细胞悬液，将每种浓度的悬液选取1ml 均匀铺平在直径为10cm 的培养皿中，随后放入37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔3 日换一次液。14d 后终止培养，PBS 清洗3 遍后使用4%多聚甲醛固定30min，使用PBS 再次清洗3 遍后使用0.2%结晶紫进行染色，染色15min 后使用PBS 再次冲洗，室温下干燥。镜下，以大于等于50 个细胞作为一个集落进行观察。 1.2 siRNA 的合成与转染 实验参照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)细胞转染说明书进行。细胞消化分孔(6 孔板)，两个离心管分别加入100ul RPMI-1640(Gibco，美国)，1 号离心管加入Lipofectamine 2000，2 号离心管加入1ug DNA(100pmol siRNA)。将脂质体稀释液加入至2 号离心管，RPMI-1640 过洗一遍转染的细胞，加入RPMI-1640 0.8ml/ 孔。siRNA 转染设置空白对照组和阴性对照，过表达转染设置空白对照和空载转染组。将DNA-脂质体(siRNA-脂质体)混合物加入培养皿，放入37℃，5%CO2温箱中孵育。5h后，换10%FBS-RPMI1640 培养液，继续培养48小时后进行后续实验。 1.3 siEZH2 效率验证 Western Blot 检测三组牙周膜干细胞EZH2 转染后siEZH2-1、siEZH2-2、siEZH2-3 转染效率，选取其中转染效率最高的一组进行下一步实验。 使用LPS 刺激牙周膜干细胞、空转牙周膜干细胞siNC 和已敲减EZH2 的牙周膜干细胞siEZH2，验证在LPS 刺激情况下EZH2 基因的转染抑制是否受到影响。 1.4 Western Blot LPS 模拟炎症环境时PDLSCs 中EZH2 表达的变化：使用不同浓度LPS刺激牙周膜干细胞48h，细胞分组：1.牙周膜干细胞组；2.牙周膜干细