电镜超薄切片2.pptVIP

电子显微术 ;;一、????????????? 电子显微镜的发展史 1、光学显微镜的极限 光学显微镜的分辨本领大约是可见波长的一半，可见波长为400--800nm，所以光学显微镜的分辨本领大约是0.2um。 2、 1924年，法国科学家德.布罗意证明了任何一种快速运动的粒子，都具有波动性。 1926年德国科学家布许发现，高速运动的电子在电场或磁场下，会发生折射，并且能被聚焦。高速运动的电子具有波动性和折射性是电子显微镜的基础。 20世纪30年代，经过鲁斯卡、克诺尔、马顿等科学家的不懈努力，终于在1938年试制成功第一台实用电子显微镜。 ;２０世纪３０年代电子显微镜问世，６０年代电镜技术和生物样本制备技术获得进展。后发展了扫描电镜术、冷冻复型术、高压电镜术、Ｘ线显微分析术、扫描隧道显微术和原子力显微术等。;;第一节、透射电子显微术 一、????????????? 透射电镜的原理 1 高速运动的并具有波动性和折射性的电子 2 电镜的各种像差 1）球差：是由于透镜不能把所有的入射光线聚集共同的焦点而产生的。 2）像散：这一缺陷主要是由于电子透镜实际上不可能做得完全对称。 3） 色差：可见光的波长不同。 4）畸变:在低倍镜时经常发生.因为图像中心部分和周边部分的放大倍数不同.; 二、透射电子显微镜的结构 1 电子枪 2?????? 聚光镜系统 3?????? 样品室 4?????? 成象系统:物镜、 第一中间镜、 第二中间镜、投影镜。 5?????? 观察和记录系统;三、透射电镜的使用 1 加速电压的选择：40-100kV可以一档一档的调节。加速电压对电镜的性能有以下的影响：一般样品薄时40-60KV，一般样品60-80KV，厚时100KV。 1） 电压越高，电子穿透能力越强； 2）对于某些生物制品，电压越高，图象反差越小； 3）电压升高电子枪亮度增加，荧光屏亮度也增加； 4）电压升高对提高分辨率有利。;2 聚光镜光阑和物镜光阑的选择 聚光镜光阑：200-300um;物镜光阑：20-70um. 3 放大倍数的选择 选择放大倍数的两个原则：①感兴趣的区域充满整个照相底片；②感兴趣的细节特征十分容易测到。;4．选视野、调焦和拍照 （1）把要拍照的视野移至屏中心6×9黑框内。 （2）用OB FOCUS调焦，拍照前使OB置于稍欠焦位置上以增加反差。 （3）核对是否存有像散，核对光斑是否居中，核对灯丝是否饱和对称。 （4）根据事先已在计算机上设定好的最佳光强度，调节BRIGHTNESS，使PAG1上的 EXP TIME为设定值（参考第三章）。 （5）盖上观察窗，按下PHOTO，即自动曝光。 ;透射电子显微镜生物制品制备技术 ;;;;;冰冻蚀刻复型术 冰冻割断术Freeze etch replica Freeze cracking;电镜细胞化学术electron microscope cytochemistry ;免疫组织化学技术 免疫电镜术 Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy ;电镜放射自显影术 显微放射自显影技术Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography;扫描电镜技术 Scanning electron microscopy SEM;现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类： 一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法； 另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。 ;1、????? 超薄切片样品的制备 （1）?? 取材( 基本要求是在活体情况下进行) 取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则） 1）? 快速：1分钟之内投入固定液。 2）?? 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。 3）?? 部位准 4）? 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。 5）??? 低温：0-4oC ;取材的方法 1）动物材料： 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。;;2）培养细胞(Cell culture)： 生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。;3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛