克隆基因的具体表达形式.ppt

第九章 克隆基因的表达;遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（central dogma）。 ;二、克隆基因的表达：;;用原核生物作宿主。;识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。;有意义链;;4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。;二、原核表达系统的注意事项;是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 ;consensus sequences;5’-TTGACA-3’ ;原核启动子共有序列的相对位置;（2）翻译的起始位点;AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）;全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。 ;3. 转录终止子;由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。 ;;大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码UAA，UAG，UGA，防止核糖体跳跃（skipping）。;① 必须是一种强启动子;来自大肠杆菌的乳糖操纵子。;;;阻遏物与DNA的结合;乳糖操纵子控制区的结构;环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。 CAP的功能：显著提高酶与启动子结合常数：①CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向，以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。②CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。 ;;;;;（3）色氨酸启动子trp;色氨酸操纵子;trpR;trpR;（4）PL和PR启动子;cIII;cI857:;;;四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位;;;2. 周质中表达;phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 ;鼠源RNase、人生长激素信号肽。;由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。;;载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。;哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。;④终止子：;;必须选择一个有lacI???宿主菌。;载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。;;pIN III-comA1;表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。;lacI;（4）产物分离;pGEX; ;（5）其他融合蛋白系统;人胰岛素在大肠杆菌中的表达;5’-TTGACA-3’ ;（2）-35区与-10区之间的距离;5’-AGGAGGU-3’ ;AUG左侧的三个碱基也有影响。 ;3. 启动子与外源基因之间的距离;转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。;选择强启动子序列，如tac 等;;cI857阻遏物有活性，抑制?PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。;调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。;（2）表达载体诱导复制 ;温度控制诱导DNA复制的质粒pCI101;N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。;??Z系列载体：;①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ②大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 ③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。;（3）表达分泌蛋白 ;细菌蛋白分泌的条件：;;八、细菌表达载体举例;pTYB1, pTYB2的 MCS;2. pTYB11，pTYB12:内含肽intein在N端;pTYB11, pTYB12的 MCS;利用Intein 分离纯化外源蛋白;;3. pTYB系列的特点;九、外源蛋白质表达后的正确修饰;人胰岛素分子;;如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。;;（2）N-糖基化（Asn）;甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化;缺乏蛋白质的加工。 （如糖基化、氨基酸修饰等）。;酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。;① 能在E.coli中克隆和扩增。;Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells;由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段