一株多形炭角菌的分离鉴定及其生长特性研究.docxVIP

? ? 一株多形炭角菌的分离鉴定及其生长特性研究 ? ? 何山文 雷 琼 马立安* （1长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；2荆州文物保护中心，湖北荆州434020） 多形炭角菌（Xylaria polymorpha）属于菌物界，子囊菌门，盘菌亚门，粪壳菌纲，炭角菌亚纲，炭角菌目，炭角菌科，炭角菌属。多形炭角菌主要生长于林间腐木、树皮裂缝中[1]。研究表明，多形炭角菌具有药用价值[2]，是天然产物的丰富来源。JANG等[3-4]不仅从多形炭角菌子实体的甲醇提取物分离到亚油酸、亚油酸甲酯及麦角甾醇等多种生物活性物质，还分离到2种聚丙酸酯xylarinic acids A和B（具有清除自由基、抗真菌与抗炎活性）。杨宁宁等[5]从多形炭角菌菌丝发酵产物乙酸乙酯部分中分离鉴定出具有乙酰胆碱酯酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗线虫活性的新物质。由于多形炭角菌的资源比较匮乏，难以大量收集，其大规模开发利用受到限制。 笔者对一株疑似炭角菌属的大型野生真菌进行组织分离，并通过真核生物核糖体基因ITS序列对其进行鉴定并研究其培养特性，为其人工驯化栽培及产业发展提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试菌株采自英国诺里奇东安吉利亚大学校区林间的野生大型真菌（图1），保存于长江大学生命科学学院微生物实验室。 供试基础培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氢钾3.0 g，硫酸镁1.5 g，去离子水1000 mL，pH自然。 1.2 试验方法 1.2.1 菌株的分离纯化 将野生菌进行酒精消毒后，取子实体部分接于PDA培养基上，28℃恒温箱中培养，4 d后挑取边缘菌丝转接，转接2～3次，经镜检无杂菌后即得到纯化的菌株，编号为T-18。 1.2.2 形态学鉴定 将菌株接种于PDA培养基上，7 d后观察记录菌落特征、菌丝形态。 1.2.3 分子系统鉴定 将菌丝置于PDA液体培养基中培养3 d，离心取出菌丝后采用改良的CTAB法[6]提取DNA。PCR扩增引物：ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，ITS5：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，PCR 反应体系（50 μL），其体系为 10×Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，Taq（2 U/μL）1 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 33 μL，DNA模板4 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。0.8%的琼脂凝胶电泳检测后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 1.2.4 菌丝生长特性研究 保存的菌种接种到PDA培养基上，放入25℃恒温培养箱培养5 d进行活化。取1 cm2左右活化菌种接种进装有150 mL基础培养基的三角瓶中，放置于25℃、转速为100 r/min的温控摇床培养5 d，制成种子液备用。 1.2.4.1 碳源对菌丝体生长的影响 以不加葡萄糖的基础培养基为空白对照，以基础培养基中葡萄糖的含碳量为标准，以相同含碳量的蔗糖、乳糖、麦芽糖、α-可溶性淀粉分别代替葡萄糖，共6个处理，每个处理3次重复。培养基装液量50 mL/100 mL三角瓶，等量接种，放置于25℃、转速为100 r/min的恒温摇床培养7 d。培养结束后，取发酵液过滤，收集菌丝体。菌丝体于50℃烘干12 h至恒重后称重。计算菌丝体产量（平均每100 mL发酵液得到的菌丝体干重）。 1.2.4.2 氮源对菌丝体生长的影响 以不加蛋白胨的基础培养基为空白对照，以基础培养基中蛋白胨的含氮量为标准，以相同含氮量的牛肉膏、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠分别代替蛋白胨，研究氮源对菌丝体生长的影响。共7个处理，每个处理3次重复。其他步骤同1.2.4.1。 1.2.4.3 无机盐对菌丝体生长的影响 以不加磷酸二氢钾和硫酸镁的基础培养基为空白对照，选用硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸钾6种无机盐进行试验。其他步骤同1.2.4.1。 1.2.4.4 温度对菌丝体生长的影响 液体培养基为基础培养基，培养温度为15、20、25、30、35℃，共6个处理，每个处理3次重复。其他步骤同1.2.4.1。 1.2.4.5 pH对菌丝体生长的影响 液体培养基为基础培养基，pH设置为3、4、5、6、7、8、9，每个处理3次重复。其他步骤同1.2.4.1。 1.2.5 数据处理 以菌丝体生物量作为指标，绘制柱状图。采用SPSS 19.0对试验数据进行统计分析，用LSD法比较各因素对菌丝产量的差异显著性影响。 图1 样品子实体形态 图2 样品菌落平板形态 图3 ITS片段PCR产物电泳图 2 结果与分析 2.