酵母双杂交系统检测SK2通道和RyR2的相互作用的开题报告.docx

酵母双杂交系统检测SK2通道和RyR2的相互作用的开题报告 一、研究背景和意义 心脏肌细胞的收缩和松弛是由钙离子通过细胞质中钙离子释放通道和钙离子再摄取通道的互作而完成的。而钙离子释放通道RyR2和钾离子通道SK2是心脏肌细胞中的关键分子，它们的相互作用对心脏肌的收缩和松弛起着重要作用。因此，研究它们之间的相互作用机制，对于理解心力衰竭等疾病的发病机制，有着重要的意义。 传统的方法，如共沉淀、免疫共沉淀等，虽然可以检测蛋白质之间的相互作用，但存在着许多局限性，如檫抹效应、背景噪音等。因此，利用酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用，具有操作简单、可靠性高、选择性好等优点，已经成为分子生物学中广泛应用的一种技术。 二、研究内容和方法 本研究旨在利用酵母双杂交系统检测SK2通道和RyR2的相互作用。研究内容主要包括以下几个方面： 1、构建酵母双杂交库 首先需要从人的心脏组织中提取总RNA，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增出SK2和RyR2的基因，然后将SK2和RyR2基因的cDNA克隆到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中，形成稳定表达的酵母双杂交子。 2、酵母双杂交筛选 将构建好的酵母表达载体pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2共同转化到酵母裂解病毒感受态菌株Y2HGold中，利用酵母双杂交筛选检测宿主菌中SK2和RyR2的相互作用。通过选择性培养基的筛选，实现对与SK2有相互作用的RyR2的鉴定。 3、鉴定和验证SK2和RyR2的相互作用 将筛选出的阳性菌落进行PCR扩增，验证插入的cDNA片段，然后进行测序分析，并进行BLAST检索确认。同时，通过Western blot等技术手段验证SK2和RyR2是否存在相互作用。 三、预期结果 预计通过酵母双杂交系统检测SK2通道和RyR2的相互作用，并验证鉴定的阳性菌落是否存在相互作用。最终，为进一步深入研究它们之间的作用关系提供了方便，同时也为阐明它们在心脏肌收缩和松弛过程中的机制提供了理论基础。 四、结论 本研究旨在利用酵母双杂交系统检测SK2通道和RyR2的相互作用。该方法简便、可靠、操作简单，预计可以筛选出与SK2相互作用的RyR2等相关分子，并为进一步深入研究钙离子信号转导通路提供理论基础，从而为阐明一些心脏疾病的机制提供理论基础。