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蛋白提取方法 No.1 单层贴壁细胞总蛋白的提取 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH=7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 于4℃下12000 rpm离心5min。（提前开离心机预冷） 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。 No.2 组织中总蛋白的提取 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。 No.3 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1）操作外还应收集培养液中的细胞。 培养液中细胞总蛋白的提取 将培养液倒至15ml离心管中，于2500 rpm离心5min。 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 用枪洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。 No.4 Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白 细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）； 预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）； 去上清，后甩一次，将上清去尽； 按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading； Vortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝； 每次煮好将其放于冰上，静置约2min，Vortex一下，再甩一下； 三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可； 每次上样约5ul（50ug/ul蛋白） No.5 RIPA裂解抽提总蛋白 细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）； 预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）； 去上清，后甩一次，将上清去尽； 按照如下比例加入裂解试剂： RIPA：300ul/1×107细胞 PMSF：3ul(1:100) Cocktail：0.3ul(1:1000) 吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟Vortex一次； 4℃预冷离心：10000rpm ×10min； 收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。 No.6 核、浆蛋白抽提 一.收核-浆蛋白 收浆蛋白 细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）； 用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）； 去上清，加入A Buffer 1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）； 去上清，加入A’ Buffer 250uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）； 收核蛋白 再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净； 剩余沉淀中加入B’ Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）； 离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。 Buffer A的配制： _ 终浓度 母液 配40Ml (10ml)溶液所需的量 Hepes PH 7.9 10mM 1M 400uL/(100ul) MgCl2 1.5mM 2M 30uL/(7.