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　　被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 思考: 形成的粘性末端可能不同，也可能相同 不同的限制酶呢？ 具有 * 寻根问底 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 * 2：基因工程的 指“DNA连接酶” “ ” 2）作用： 连接“梯子”断口的“扶手”而非“梯子”中间的“踏板”。 其作用与限制性内切酶相反，作用点相同 1） 连接部位：磷酸二酯键 * DNA连接酶的作用过程 将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 3）结果： * 思考：两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，再用DNA连接酶连接，会怎样呢？ * “分子缝合针”——DNA连接酶 两者都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷之间的磷酸二酯键。 但E·coli DNA连接酶只能“缝合”黏性末端不能“缝合”平末端； 而T4 DNA连接酶既能“缝合”黏性末端又能“缝合”平末端。 根据来源不同可分为 : E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 在性质上两者 异同点： * DNA聚合酶 DNA连接酶 区别 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? 将单个核苷酸之间形成磷酸二酯键，聚合成DNA 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 * ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… EcoRⅠ ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… 不同来源的DNA片段混合 将不同种来源的DNA片段连接起来 生物A基因片段 生物B基因片段 ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… 酶切 ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… 同一种 * 3、基因的运输工具——运载体 作用：将外源基因送入受体细胞。 条件： （1）能在宿主细胞内复制并稳定地保存。 （2）具有多个限制酶切点，以便于外源基因 相连。 （3）具有某些标记基因，便于筛选 种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 * 标记基因，便于进行检测。 常用的载体：质粒 双链环状的DNA分子 本质： * 基因工程的基本工具 * １、获得目的基因 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪去多余部分 目的基因 四、基因工程基本步骤： 如果序列是已知的，有两种方法： ①化学方法合成 ②用PCR方法扩增 如果序列是未知的：从基因文库中获取 * 提取目的基因的方法 ⑴直接分离基因(从基因文库中获取）——鸟枪法 　　将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。　该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。 ⑵人工合成基因法 有两种方法：　　　 ①直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。 * DNA合成仪 （3）利用PCR技术扩增目的基因 ②逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。 * 2、目的基因与运载体结合形成重组DNA分子 注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。 核心 * 基因表达载体的构建——核心 质粒 DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 * 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资 料: * * * 你们好 每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。