二代测序文库构建.ppt

二代测序（WGSWES） 文库构建流程介绍 韩丽萍 2019.4.12 目录 01 基本概念介绍 基本概念介绍 全基因组重测序（ Whole-Genome sequencing, WGS ）是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。 外显子组测序（ Whole-exome sequencing, WES ）是利用设计好的探针将坐标已知的全基因组外显子区域的DNA捕捉并富集后，进行高通量测序的基因组分析方法。 对于人类基因组来说，外显子区域大概占到基因组的1%，大概在30M左右。一般WES的测序深度为50X~200X，具体深度依研究目的而定，其中个体之间的变异程度较WGS小。 Reads in IGV Integrative Genomics Viewer(IGV) 是一款针对高通量测序数据进行可视化的专业软件。它支持各种数据类型，包括基于芯片测序、二代测序和基因组注释数据等。可以帮助用户对分析结果中的相关文件在可视化的条件下进行浏览分析。 02 基础文库构建 文库分子模型 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 WGS:300-400bp WES:150-250bp 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 末端修复 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 Indexed Adaptor General Adaptor 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 扩增 扩增 P5、P7引物 P5端通用引物（一种） P7端含有index的引物（多种） 通过加接头引入index 通过PCR扩增引入index 随机打断DNA 末端修复 3’端加A（dATP） 加接头 PCR扩增 文库质检 On PCR 磁珠纯化与片段分选 片段分选第二步去掉小片段 片段分选第一步去掉大片段 03 杂交捕获技术 液相杂交捕获技术介绍 利用寡核苷酸序列合成技术，合成大量生物素标记的RNA/DNA“诱饵”，利用碱基配对原理，通过生物素与链霉亲和素的结合将目标区域进行富集的技术。 常用的液相杂交捕获试剂主要有Agilent、Roche和illumina，国内的主要是艾吉泰康。 ◆ 封闭与杂交： （预文库/Blocking oligos） + [杂交捕获液/生物素标记探针/RNAase抑制剂] 。 95度变性解链，65度退火复性，杂交16-24h。 生物素标记的探针（RNA, 120~nt） Cot-1 blocker 接头 blocker 外显子 Cot-1重复序列 接头 ◆ 捕获与洗脱 1、磁珠上的链霉亲和素与探针上的生物素结合（常温反应30min）。 ◆ 捕获与洗脱 2、含有Complex的离心管放置到磁力架上等液体澄清以后，将上清去除即可去除多余或未利用的“Blocking oligos、生物素标记探针”以及“杂交捕获液”。 3、 65度条件下进行洗脱，去除非特异性片段。 杂交、捕获与扩增-1 杂交、捕获与扩增-2 杂交、捕获与扩增-3 质量浓度：ng/ul 文库长度：bp 文库实际有效浓度：摩尔浓度 估算文库摩尔浓度 04 疑问与讨论