DB64 829_2013葡萄苗木病毒检测技术规程.pdf

ICS 65. 020B 16DB64宁夏回族自治区区地方标准DB 64/T 8292013葡萄苗木病毒检测技术规程Rules for virus detection of seedling grapevine2013-01-04发布2013-01-04实施宁夏回族自治区质量技术监督局发布 DB64/ T 829—2013前言本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。本标准由宁夏回族自治区林业局提出并归口，本标准主要起草单位：宁夏林业研究所股份有限公司、国家经济林术种苗快繁工程技术研究中心、宁夏森淼种业生物工程有限公司。本标准主要起草人：徐美隆、沈效东、陈春、王国珍、邱文平、李永华。 DB64/ T 829—2013葡萄苗木病毒检测技术规程1范围本标准规定了葡萄苗本病毒检测技术的术语和定义、检测对象、取样部位、抽样、检测方法和质量要求。本标准适用于葡萄母本树、组培苗、扦插苗、嫁接苗的病毒检测。术语与定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1脱毒葡萄母本树由脱毒苗直接繁育或是通过田间选择的优良株系，经检测不带有规定的检测对象，用于提供葡萄种条的母株。2. 2葡萄苗木通过托插、嫁接、组培等方式繁育的葡萄种苗。3检测对象葡萄苗木病毒主要检测对象：a)葡萄扇叶病（Grapevine fanleaf virus,GFLV）;b) 葡葡卷叶病 (Grapevine leafrol1 associated virus 1, GLRaVI):c)葡葡卷叶病II (Grapevine leafrol1 associated virus 2, GLRaVII);d)葡萄卷叶筛III(Grapevine leafro11 associated virus 3, GLRavIID);e) 葡萄病毒A(Grapevine virus A，GVA);f)葡萄病毒 B(Grapevine virus B, GVB)。4取样部位病毒检测取样部位见表1。表1 取样部位病毒种类取祥部位葡萄扇叶病(GFLY)幼嫩叶片 DB64/ T 8292013表1(续)病毒种类取祥部位葡萄卷叶病-1(GLRaV-I)休眠枝条韧皮部葡萄卷叶病-II (GLRaV-II)休眠技条韧皮部葡萄卷叶病III (GLRaVIII)休展技条韧皮部葡萄病毒A（GVA)休眠枝条韧皮部葡萄病毒B（GVB)体眠枝条韧皮部抽样5. 1脱毒母本树的抽样每株均需检测。5. 2出面苗木的抽样采用随机取样方法抽取出面苗木进行病毒检测。以1万株抽检10株为基数（不足1万株以1万株计），10万株内（含10万株），每增加1万株增检5株，超过10万株，每增加1万株增检2株。6检测方法6. 1双抗体夹心酶联免疫检测法（DAS-ELISA检测法）检测方法见附录A。6. 2反转录-聚合酶链式反应检测法（RT-PCR检测法）检测方法见附录B。7质量要求7. 1凡酶联免疫检测或RT-PCR检测呈阳性反应的为带毒苗木，7. 2脱毒母本树：病毒株允许率为0。7. 3出围苗本；病毒株允许率≤3.0%，2 DB64/ T 8292013附录A（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫检测法（DAS-ELISA）A. 1溶液配制所用化学试剂均为分析纯级规格，用水为蒸增水。A. 1. 1抽提缓冲液抽提缓冲液的配制见表A.1.表A.1抽提缓冲液的配制药品名称质量/体积三羟甲基氨基甲烷(Tris)60. 50 氧化钠(NaC1)8. 00 s聚乙烯吡喀烷酮（PVP），MW4000020. 00 g聚乙二醇（PEG)10, 00 g叠氰化钠(Na%）2. 00 g吐温20 (Tween-20)0. 50 6注：将以上药品依次溶于900nL蒸错水中，用盐酸将溶液pH值调整到8.2，翼用蒸缩水定客室1000nL，4C下保存，有效期1年。A. 1. 2洗涤缓冲液洗涤缓冲液的配制见表A.2。表A2洗涤缓冲液的配制药品名称质量/体积氮化钠(NaC1)8, 00g磷酸氢二销（NalPO,）1. 15g磷酸二氨钾（KH,PO.）0. 20g氧化钾(KC1)0. 20g旺温20 (Treen20)0, 50g注：溶于900mL蒸馈水中，用盐酸将溶液pH值调整到7.4，再用费溜水定容至1000al.，4℃下保存，有效期1年，A. 1. 3包被缓冲液包被缓冲液的配制见表A.3。3 DB64/ T 8292013表A.3包被缓冲液的配制药品名称碳酸钠(Na00,)质量/体积碳酸氨钠（NaHCO,）1.59g叠氮化钠（Na%）2.93g注：落于900mL蒸水中，用盐酸将溶减p值调整到9.6，汽用器境水定客至1000aL，4C下保存，有效期1年。0. 20gA. 1. 4酶标抗体稀释缓冲液酶标抗体稀释缓冲液的配制见