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流式triton x100破膜染色实验步骤 一、溶液与试剂 注：利用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。 1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制1 L的1X PBS：添加100 ml 10X PBS(HYPERLINK/product/productDetail.jsp?productId=12528#12528)至900 ml水，然后将其混合。 4%甲醛，无甲醇(HYPERLINK/product/productDetail.jsp?productId=47746#47746) 细胞通透缓冲液：购买即用型(HYPERLINK/product/productDetail.jsp?productId=39487#39487)或者通过添加30μl Triton?X-100至10 ml抗体稀释缓冲液来制备10 ml。4°C保存。 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液(HYPERLINK/product/productDetail.jsp?productId=13616#13616)，或在100 ml 1x PBS中溶解0.5 g牛血清白蛋白(BSA)(HYPERLINK/product/productDetail.jsp?productId=9998#9998)来制备0.5%BSA PBS缓冲液。4°C保存。 推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与您的一抗（例如兔）的宿主物种匹配的二抗。HYPERLINK/browse/flow-cytometry/secondary-antibodies?N=4291883758+4291883759+102287+4294956287\t/learn-and-support/protocols/_blank点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。 二、固定与透化 注：固定前，应分离贴壁细胞或组织，使它成为单细胞悬浮液。 注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5分钟150-300g将足以使细胞沉淀下来。 注：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。 注：如果表位被甲醛和/或Triton?X-100破坏，可以在固定前添加靶向CD标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定，请进行小规模实验。 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。 按每100万个细胞大约100μl 4%甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。 室温(20-25°C)固定15分钟。 通过离心用过量1X PBS洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。 在每一百万个细胞约100μl细胞透化缓冲液中重悬细胞。 在室温孵育10分钟。 继续进行染色或将细胞在PBS中-4°C保存过夜。 三、免疫染色 注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用5x105至1x106个细胞）。 将细胞离心，弃去清液。 在100μl稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。 室温(20-25°C)孵育1小时。 在抗体稀释缓冲液或1X PBS中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤9。 在100μl稀释的荧光素偶联的二抗（按建议的稀释比例用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。 在室温(20-25°C)下孵育30分钟。避光。 在抗体稀释缓冲液或1X PBS中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。 在1X PBS中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。