DB37T 605-2006鸡肝中氯霉素残留量的测定 酶联免疫吸附法.pdf

ICS 65.020.30B40DB备案号山長东省地國方标准DB37/T605—2006鸡肝中氯霉素残留量的测定酶联免疫吸附法Determination of chloramphenicol inchicken liverenzymelinked immunosorbent assay200X-X×-××发布2006-07-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T605—2006前言本标准由山东省备牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出，本标准负责起草单位：山东省畜产品质量检测中心。本标准主要起草人：高迎春、陈玲、冯修光、魏秀丽， DB37/T605—2006鸡肝中氯霉素残留量的测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了鸡肝中氧霉素残留量的酵联免疫吸附测定方法。本标准适用于鸡肝中氯霉素残留量的快速检测。本方法检测限为100ng/kg.该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理酵联板的微孔板包被有针对免IgG（氯霉素抗体）的羊抗体。加入氯霉素抗体，氯霉素酵标记物氯霉素标准或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体。同时氯霉素抗体也与固定的羊抗体结合。通过洗涤除去没有结合的点毒系酶标记物。将酵基质和发色剂加入到孔中并且孵育。结合的激毒素酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后由蓝色转变为黄色。用酶标仪在450nm测定其吸收度，用标准曲线计算。4试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。4. 1乙酸乙酯（CHC00C,H;）4.2乙睛(CHCN)4. 3正已烷[CH, (CH,),CH,]4.4三氯甲烷（CHC1,）4.5标准浓缩液4. 6氯毒系酶标记物4. 7氯霉素抗体4.8基质4.9发色剂4. 10反应终止液4. 11缓冲溶液5.仪器5. 1分析天平：感量0.01g。5. 2离心机（5000r/min)5.3微量移液器：单道1μL100μL：多道50μl~250μL5.4均质器5.5振荡器5.6酵标板1 DB37 /T605—20065.7酵标仪测定步骤使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整6.1试料的提取取鸡肝样品约20g，以10000r/min匀浆2min，称取5g匀浆物（精确至0.01g），加入20ml乙腈水溶液（84+16），于振荡器上震荡30min.3000r/min离心10min，取3mL上层液与3mL蒸馏水混合，加入4.5mL乙酸乙酯（4.1）振荡提取，3000r/min离心10min，将上层有机相转移至试管中完全蒸发干，用1.5mL缓冲液（4.11）溶解残留物，加入1.5mL正已烷（4.3）脱脂；完全除去上层的正已烷：取50μL下层的水相进行分析。6.2测试程序6.2.1取出酶标板(5.6)及所有试剂，使试剂盒温度升至室温，6. 2. 2加入用缓冲溶液（4.11）10倍稀释的酵标记物（4.6）50μL，再加入用缓冲溶液（4.11）10借稀释系列标准溶液（4.5），空白试料溶液，试样溶液各50μL到各自的微孔中，6.2.3加入用缓冲溶液（4.11)10倍稀释的抗体（4.7）50μL,封口膜封板，室温孵育30min。250L到酶联板的微孔内，然后倒出孔内液体，如此重复操作三次。6. 2.5加入50μL基质（4.8）和50μL发色剂（4.9）到每一微孔中，室温避光孵育30in。6.2.6加入100μL发应终止液（4.10）到每一微孔中，混合好用酶标仪在450nm处测量吸光度值。以零标准吸光度值A为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸光度百分比为级坐标，对应的各标准溶液浓度为横垒标，绘制标准曲线。待测样品根据其吸光度，查标准曲线得到氯毒素的含量 (m)7结果计算试样中氯霉素的含量（X）以μg/kg表示，按公式(1)计算X=m× Dm式中：0/从标准曲线上查得的试料提取液中的氯霉素的质量，单位为纳克(ng)：试料质量，单位为克（g)：稀释倍数。以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。计算结果保留三位有效数字，8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。N