DB37_T 1828-2011猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术.pdf

ICS 65. 020. 30B 40DB37山 長东省地方标准DB37/流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术RT-PCR Assay for the Detection of Swine Epidemic Encephalitis B201104-08发布2011-06-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/ T XXXX—XXXX前言本标准的编制依据GB/T1.1-2009的规定。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，I DB37/ T XXXX—XXXX猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术1范围本标准规定了猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测技术的操作要求，本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。2实验室生物安全要求实验室必须为生物安全II级（BSL-2级）以上实验室。3试剂3. 1变性液：见附录A.1。3. 22M酷酸钠溶液(pH4.0)：见附录A.2。3. 3水饱和酚（pH4.0）3. 4氯仿/异戊醇混合液：见附录A.3。3. 5AMV反转录酶（200U/μL）。3. 6RNA酶抑制剂(40 U/μL)3. 7Taq DNA聚合酶(5 U/μL)3. 81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.4。3. 950×TAE缓冲液：见附录A.5。3.10澳化乙锭(10μg/μL)：见附录A.6。3. 11加样缓冲液：见附录A.7。3.12焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录A.8.3.135×反转录反应缓冲液：见附录A.9。3.142.5mmo1/L dNTPs：见附录A.10.3.1510×PCRBuffer：见附录A.11.3. 16DNA分子量标准2000bp。3.17Eagles液3. 18引物：I DB37/ T XXXX—XXXX上游引物P1：5°ATCCTGGCTATGCTTTCCT3°:扩增片断长度819bp.操作程序4.1样品的采集和处理：4. 1. 1样品的采集流产胎儿脑组织、2发病公猪精液或蚊子，置于-20℃或液氮中保存。4. 1.2样品的处理4. 1. 2. 1组织样品处理：取待检脑组织病料0.5g或公猪精液200μL，加入400μL变性液混匀研磨。取已研磨好的待检组织样品上清200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入200L变性液，混勾。4. 1.2. 2蚊子样品处理：从-20C冰箱或液氮罐中取出蚊子样品，倒入研磨器，加入1mLHankS液清洗，吸出液体在研磨器中加入1mLEag1es液，将蚊虫样品研磨成匀浆，将研磨液约1mL吸入离心管，4℃ 12 000rpm离心 20 min上清液用0.22um规格的滤器过滤，备用。4. 1. 2. 3阳性对照处理：取乙脑病毒弱毒疫苗200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加入200L变性液，混勾。4. 1. 2. 4阴性对照处理：取健康猪脑组织或精液200μl，置1.5mL灭菌离心管中，加入200μL变性液，混勾。4. 2RNA的提取4. 2. 1设立阳性、阴性样品对照。4. 2.2异硫氰酸胍一步法4. 2. 2. 1向组织或细胞中加入200μL变性液，匀浆。4. 2. 2. 2将匀浆混合物移至新的1.5mlL离心管中，向每毫升变性液中立即加入100μL乙酸钠、1mL酚、200μL氯仿-异戊醇。加入每种试剂后，盖上试管盖，倒置混勾。4. 2. 2. 3将勾浆混合物剧烈振荡10s，冰浴15min。4. 2. 2. 4上述勾浆混合物12000rpm，4℃离心20min，将上层水相移入新的1.5mL离心管4. 2. 2. 5加入等体积的异内醇，充分混匀，于-20C沉淀RNA至少1h，4. 2. 2. 64℃12000rpm离心10min，弃上清，用75%的乙醇洗涤沉淀，离心，彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于50μLDEPC处理的水中，-20℃贮存，备用。4. 2. 3也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取，4. 3反转录4. 3. 1反转录20μL体系表1RNA5 μ L反转录引物1 μ L2. 5mo1 /L dNTPs2 μ L2 DB37/ T XXXX—XXXX70℃作用5min，冰浴2min4. 3. 2继续加入表25X反转录酶反应缓冲液4 μ LAIV反转录酶0. 8 μ LRNA酶抑制剂0. 5 μ LDEPC水6. 7 μ L瞬时离心后，于42℃温度下处理45min，再以95℃C灭活10min.取出后直接进行PCR，或置于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性对照和阴性对照。4. 4PCRPCR为50μL体系，包括：表3双燕灭菌水37. 5 μ L反转录产物4 μ L. 上游引物0. 5 μ L下游引物0. 5 μ